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Activación genética: un determinado gen o elemento cis se agrega al genoma individual en una ubicación específica para expresarse o funcionar, estudiando así la función del gen o elemento cis en el cuerpo. 4. La tecnología de orientación genética es un método experimental para realizar cambios direccionales en la información genética biológica. Su generación y desarrollo se basan en los logros de la tecnología de células madre embrionarias y la tecnología de recombinación homóloga, y promueven un mayor desarrollo de tecnologías relacionadas. Desde el establecimiento de la tecnología de células madre embrionarias tempranas y el nacimiento de ratones con genes knockout en 1987, la investigación sobre la selección de genes ha progresado rápidamente, provocando cambios revolucionarios en la biología y la investigación médica modernas y desencadenando directamente varios aspectos de la biología y la investigación médica modernas. El campo se ha convertido en uno de los métodos más directos y eficaces para estudiar la función genética en la era posgenómica. 1. Las líneas de células ES de ratón utilizadas para la adquisición y el cultivo de células madre embrionarias para la selección de genes son D3, E14, R1, J1 y CCE, todas ellas derivadas de la cepa de ratón 129 y su descendencia híbrida. Las líneas celulares ES623 y B6-IIES se derivan de la cepa de ratón C57BL/6. BALB/c-I, derivado de la cepa de ratón BALB/c. Una célula alimentadora comúnmente utilizada es PMEF (fibroblasto embrionario primario de ratón). En el proceso de establecimiento de células ES, es mejor utilizar fibroblastos embrionarios de ratón primarios que solo han pasado durante 2 o 3 generaciones como células alimentadoras. La posibilidad de establecer una línea de células ES a partir de la ICM (masa celular interna) es de solo 10. % -30 %. Una vez que se ha identificado un clon ES, se debe considerar examinar el cariotipo de las células ES. 2. Análisis de cariotipo de células ES: una proporción considerable (30-50%) de las células ES no tienen un cariotipo normal, por lo que se requiere un análisis de cariotipo. Análisis de cariotipo con técnica de bandas C: las células de ratón tienen 40 cromosomas (19 más dos cromosomas sexuales). Los autosomas y los cromosomas X tienen centros más oscuros, mientras que los cromosomas Y tienen centros más claros. 3. Expansión de las células ES Una vez que se determina que una alta proporción de células en una línea de células ES tienen números de cromosomas diploides normales, las células ES requieren una expansión y criopreservación extensas. Cada 5 a 6 días, las células ES deben tripsinizarse y sembrarse en un medio nuevo a una baja densidad eficiente para mantener las células indiferenciadas. La densidad celular máxima para una placa de 60 mm es 1-2×107. Los PMEF se pueden utilizar como células alimentadoras solo después de la irradiación con rayos X de 6 Gy o el tratamiento con mitomicina C para inhibir el crecimiento celular. 2. Construcción del vector de direccionamiento El vector de direccionamiento normalmente incluye dos brazos de recombinación homóloga, que se utilizan para guiar la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y la secuencia del gen diana en el cromosoma. El brazo de recombinación homóloga contiene un gen de selección positiva (neo) y un gen marcador de selección negativo de timidina quinasa (tk) después de la selección con G418. Detección de células ES recombinantes 1. Preparación de células alimentadoras; 2. Preparación de células madre embrionarias; 3. Transfección de células ES; 4. Selección de clones ES; 5. Placa de 96 pocillos de respaldo de células ES y criopreservación de células. Preparación de ratones quiméricos; recuperación de 1. Células madre embrionarias; 2. Inyección de células madre embrionarias en blastocisto. Nota: Deje algunas células ES para inyectar al día siguiente. La inyección suele durar de 1 a 2 semanas. Inyecte las células ES en blastocistos de ratón de 3,5 días. Cada blastocisto se puede inyectar con 10 a 20 células ES. Los embriones inyectados se trasplantaron al útero de ratones pseudopreñados de 2,5 días de edad y se aceptaron entre 9 y 10 blastocistos para cada experimento uterino. 5. Establecimiento de ratones con genes knockout Seleccione crías de ratones machos con alta tasa de quimerismo × ratones hembra salvajes. 6. Sistema Cre-loxP, sistema FLP/FRT y desactivación genética condicional Cre/loxP: a partir del fago P1, el gen de la recombinasa Cre y la secuencia loxP se encuentran en el genoma del fago P1, y loxP es la secuencia de reconocimiento de la enzima Cre. FLP/FRT: De la levadura, FRT es la secuencia de reconocimiento de la enzima FLT.
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