¿Qué tipo de células son las células FRT? La orientación genética incluye: adquisición y cultivo de células madre embrionarias, construcción de vectores de orientación, detección de células es recombinantes, preparación de ratones quiméricos, establecimiento de ratones con genes knockout, sistema Cre-loxP, sistema FLP/FRT y establecimiento de una biblioteca de genes knockout condicional, knockout genético y mutaciones de células ES a gran escala. Conceptos básicos 1. Orientación genética: el uso de tecnología de recombinación homóloga para cambiar la secuencia del genoma y la estructura de especies en puntos específicos para estudiar las funciones de genes y genomas en individuos mutantes. 2. Eliminación genética: utiliza los elementos cis de uno o más genes para producir defectos en el genoma, produciendo así mutantes. 3. Pérdida de la función normal para inferir la función original de estos genes o elementos en el cuerpo. Activación genética: un determinado gen o elemento cis se agrega al genoma individual en una ubicación específica para expresarse o funcionar, estudiando así la función del gen o elemento cis en el cuerpo. 4. La tecnología de orientación genética es un método experimental para realizar cambios direccionales en la información genética biológica. Su generación y desarrollo se basan en los logros de la tecnología de células madre embrionarias y la tecnología de recombinación homóloga, y promueven un mayor desarrollo de tecnologías relacionadas. Desde el establecimiento de la tecnología de células madre embrionarias tempranas y el nacimiento de ratones con genes knockout en 1987, la investigación sobre la selección de genes ha progresado rápidamente, provocando cambios revolucionarios en la biología y la investigación médica modernas y desencadenando directamente varios aspectos de la biología y la investigación médica modernas. El campo se ha convertido en uno de los métodos más directos y eficaces para estudiar la función genética en la era posgenómica. 1. Las líneas de células ES de ratón utilizadas para la adquisición y el cultivo de células madre embrionarias para la selección de genes son D3, E14, R1, J1 y CCE, todas ellas derivadas de la cepa de ratón 129 y su descendencia híbrida. Las líneas celulares ES623 y B6-IIES se derivan de la cepa de ratón C57BL/6. BALB/c-I, derivado de la cepa de ratón BALB/c. Una célula alimentadora comúnmente utilizada es PMEF (fibroblasto embrionario primario de ratón). En el proceso de establecimiento de células ES, es mejor utilizar fibroblastos embrionarios de ratón primarios que solo han pasado durante 2 o 3 generaciones como células alimentadoras. La posibilidad de establecer una línea de células ES a partir de la ICM (masa celular interna) es de solo 10. % -30 %. Una vez que se ha identificado un clon ES, se debe considerar examinar el cariotipo de las células ES. 2. Análisis de cariotipo de células ES: una proporción considerable (30-50%) de las células ES no tienen un cariotipo normal, por lo que se requiere un análisis de cariotipo. Análisis de cariotipo con técnica de bandas C: las células de ratón tienen 40 cromosomas (19 más dos cromosomas sexuales). Los autosomas y los cromosomas X tienen centros más oscuros, mientras que los cromosomas Y tienen centros más claros. 3. Expansión de las células ES Una vez que se determina que una alta proporción de células en una línea de células ES tienen números de cromosomas diploides normales, las células ES requieren una expansión y criopreservación extensas. Cada 5 a 6 días, las células ES deben tripsinizarse y sembrarse en un medio nuevo a una baja densidad eficiente para mantener las células indiferenciadas. La densidad celular máxima para una placa de 60 mm es 1-2×107. Los PMEF se pueden utilizar como células alimentadoras solo después de la irradiación con rayos X de 6 Gy o el tratamiento con mitomicina C para inhibir el crecimiento celular. 2. Construcción del vector de direccionamiento El vector de direccionamiento normalmente incluye dos brazos de recombinación homóloga, que se utilizan para guiar la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y la secuencia del gen diana en el cromosoma. El brazo de recombinación homóloga contiene un gen de selección positiva (neo) y un gen marcador de selección negativo de timidina quinasa (tk) después de la selección con G418. Detección de células ES recombinantes 1. Preparación de células alimentadoras; 2. Preparación de células madre embrionarias; 3. Transfección de células ES; 4. Selección de clones ES; 5. Placa de 96 pocillos de respaldo de células ES y criopreservación de células. Preparación de ratones quiméricos; recuperación de 1. Células madre embrionarias; 2. Inyección de células madre embrionarias en blastocisto. Nota: Deje algunas células ES para inyectar al día siguiente. La inyección suele durar de 1 a 2 semanas. Inyecte las células ES en blastocistos de ratón de 3,5 días. Cada blastocisto se puede inyectar con 10 a 20 células ES. Los embriones inyectados se trasplantaron al útero de ratones pseudopreñados de 2,5 días de edad y se aceptaron entre 9 y 10 blastocistos para cada experimento uterino. 5. Establecimiento de ratones con genes knockout Seleccione crías de ratones machos con alta tasa de quimerismo × ratones hembra salvajes. 6. Sistema Cre-loxP, sistema FLP/FRT y desactivación genética condicional Cre/loxP: a partir del fago P1, el gen de la recombinasa Cre y la secuencia loxP se encuentran en el genoma del fago P1, y loxP es la secuencia de reconocimiento de la enzima Cre. FLP/FRT: De la levadura, FRT es la secuencia de reconocimiento de la enzima FLT.
La recombinasa Cre(FLP) tiene las funciones de eliminación/integración, inversión y translocación. La estrategia básica es introducir dos sitios loxP en la misma dirección en ambos lados del fragmento del gen que se va a eliminar mediante un método similar a la eliminación genética. El establecimiento de la eliminación genética condicional requiere tres pasos: 1. Introducir sitios loxP en la misma dirección en ambos lados del fragmento eliminado mediante recombinación homóloga (este paso es el mismo que el direccionamiento a células es, pero el vector es diferente) y transfectar con el vector de expresión transitoria de la clonación de células Cre es, reordenamiento del ADN bajo la acción de la enzima Cre. 2. Construir ratones transgénicos que expresen la enzima Cre en tejidos y etapas de desarrollo específicos. 3. Cruce los ratones obtenidos en los dos primeros pasos y examine la descendencia en busca de ratones con genes knockout en tejidos específicos. 7. Activación de genes: Activación de genes: reemplace un segmento específico del genoma con un segmento de gen diseñado e inserte el segmento de gen diseñado en un segmento específico del genoma. Esta tecnología también se basa en el sistema Cre-loxP. Hay dos métodos para eliminar el gen marcador seleccionable durante la activación del gen: el primer método es introducir recombinación homóloga de sitios loxP, introducir un vector de expresión transitoria del gen Cre, expresar Cre transitoriamente en células es y eliminar uno de los dos. Sitios loxP. Las secuencias entre ellos se utilizan luego para establecer cepas de ratón correspondientes con células ES. La segunda forma es establecer una cepa de ratón mediante la introducción de células ES que portan el locus loxP, luego cruzarlas con una cepa de ratón transgénico Cre y finalmente establecer una cepa de ratón knock-in. 8. Establecimiento de una biblioteca de mutaciones de células ES a gran escala El uso de métodos de captura de genes para establecer una biblioteca de células ES mutadas aleatoriamente en células ES es un proyecto de investigación que ha atraído una atención generalizada. Existen muchas formas de tecnología de captura de genes, y dos de las más utilizadas en el establecimiento de bibliotecas de mutaciones de células ES: captura de promotor y captura de señal 3' poli(A). Captura del promotor: combine el gen de selección libre de promotor (LacZ, neo) y la secuencia señal poliA completa en el vector de direccionamiento. Antes de seleccionar genes, se pueden colocar aceptores de empalme de ARN, los vectores se transfectan en células ES y se insertan aleatoriamente en los cromosomas de las células ES. Si el gen de detección se inserta justo aguas abajo del promotor del gen endógeno y se expresa en células ES, el gen de detección se puede transcribir y pasar la selección de resistencia. La inactivación de genes causada por la inserción es equivalente a la focalización de genes, que puede realizar una biblioteca de mutaciones genéticas de paso alto y obtener una gran cantidad de clones de células ES con objetivos de inserción claros. Captura de señal de cola 3': coloque el gen de selección que carece de señal poliA en sentido descendente de un promotor ampliamente expresado, coloque la secuencia de empalme de ARN en sentido descendente del gen de detección y construya un vector de direccionamiento. Después de transfectar células ES con este vector de direccionamiento, si el gen de detección está ubicado justo aguas arriba de la señal de cola, el gen de detección se puede transcribir con la señal poliA del gen endógeno para complementar la secuencia poliA, traduciendo así de manera inversa el gen de detección. La detección de clones de células ES resistentes puede enriquecer estos eventos de inserción.