Mecanismo de empalme de ARN
El empalme de ARN consiste en eliminar los intrones de la transcripción del gen roto. Aproximadamente 40 de los 400 genes de ARNt del núcleo de la levadura son genes fragmentados. Estos genes tienen un solo intrón, ubicado a un nucleótido de distancia del lado 3' del anticodón, y tienen una longitud de 14 a 46 pb. Los intrones en los genes de ARNt son diferentes para diferentes aminoácidos, por lo que las enzimas de corte y empalme no parecen reconocer ninguna secuencia única. Hay una secuencia en todos los intrones que es complementaria al anticodón del ARNt, lo que cambia la conformación del brazo del anticodón, es decir, el anticodón se aparea y el brazo del anticodón se alarga mucho. Sólo el brazo del anticodón se ve afectado en el precursor y el resto de la molécula de ARNt conserva su estructura normal.
El intrón del ARNtphe de levadura puede emparejarse con su anticodón, cambiando así la estructura del brazo del anticodón. Este proceso de esquila se puede dividir en dos etapas. El primer paso es la ruptura del enlace fosfodiéster, que no requiere ATP. Este paso está catalizado por una endonucleasa. El segundo paso es la reacción de ligación, que requiere la presencia de ATP y está catalizada por la ARN ligasa. En ausencia de ATP, las dos medias moléculas de ARNt producidas no pueden conectarse. Las dos medias moléculas tienen extremos únicos: un grupo OH en su extremo 5' y un grupo fosfato cíclico 2',3' en el extremo 3'. Cuando se agrega ATP, se produce el segundo paso de la reacción: las dos medias moléculas de ARNt primero se emparejan con bases para formar la conformación de la molécula de ARNt madura, y luego la ARN ligasa forma un enlace fosfodiéster para unir las dos medias moléculas. La existencia de grupos fosfato 2',3'-cíclicos no se limita a la levadura; los grupos cíclicos también se producen en reacciones de corte y empalme de ARNt en plantas y mamíferos. En las células HeLa humanas, la ARN ligasa puede conectar directamente un ARN con un grupo fosfato cíclico 2', 3' a otro ARN con un grupo 5'-OH. Los precursores de ARNt de levadura también se empalmaron correctamente en extractos nucleares de ovocitos de Xenopus laevis. Esto indica que la reacción de empalme no es específica de especie. Xenopus tiene enzimas que reconocen intrones en el ARNt de levadura. Anteriormente se pensaba que sólo las proteínas tenían actividad enzimática. Este concepto está profundamente arraigado en la comunidad bioquímica. Sin embargo, recientemente se ha descubierto que el ARN también puede tener actividad enzimática. Este tipo de ARN enzimáticamente activo se llama ribozima.
Los genes de los dos ARNr principales de Tetrahumenathermophila son similares a los de otros eucariotas (ver arriba) y se transcriben en el mismo transcrito primario. Esta transcripción se denomina ARN precursor 35S, con la secuencia de ARNr más pequeña en el lado 5' y la secuencia de ARNr más grande (26S) en el lado 3'. Hay un único intrón corto (aproximadamente 400 pb) en la secuencia codificante del ARNr 26S. Si este ARN precursor 35S se incuba in vitro, puede producirse un empalme automático: el intrón se corta del precursor, convirtiéndose primero en un fragmento de ARN lineal y luego circularizándose en un ARN circular. Esta reacción sólo requiere la adición de un catión monovalente, un catión divalente y un nucleótido de guanina (G). Ninguna otra base puede reemplazar a la G. Pero el GTP no es necesariamente necesario; se pueden utilizar GMP y guanosina. Esto significa que esta reacción no requiere suministro de energía. Además, el nucleótido de guanina debe tener un grupo 3'-OH libre. Esta G está unida al extremo 5' del intrón (a través del enlace fosfodiéster habitual). Cuando un intrón lineal se vuelve circular, su extremo 3' se puede conectar a 15 nucleótidos del extremo 5', combinando así el extremo 5' original con un segmento de 15 bases (incluido G). Esta reacción es básicamente una reacción de transferencia de fosfato. El grupo 3'-OH del exón A se puede conectar directamente al extremo 5' del exón B. Es decir, un fosfato se puede transferir directamente a otro sin pasos intermedios (como la hidrólisis), por lo que se conserva la energía del enlace fosfato. Esto explica por qué esta reacción no requiere hidrólisis de ATP o GTP para suministrar energía. Al mismo tiempo, las dos reacciones de fosfotransferencia parecían estar estrechamente relacionadas, porque nunca se encontró ningún exón libre (A o B).
La ciclación de intrones lineales puede considerarse como la tercera reacción de transferencia de fosfato. Cuando el empalme se produce en un sistema in vitro, no se requiere la presencia de la proteína. El ARN tiene la capacidad de empalmarse a sí mismo, por eso se llama autocatálisis.
T.Cech y S.Altman descubrieron de forma independiente que el ARN tiene un efecto catalítico. Cambiando así el concepto tradicional de biocatalizadores. Por ello ganaron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1989. En 1978, Altman aisló un polipéptido y un ARN (M1RNA) a partir de RNasa P purificada. Los resultados experimentales iniciales mostraron que ni la proteína ni el ARN M1 eran enzimáticamente activos por sí solos, pero que al mezclarlos se restablecía la actividad. Los resultados experimentales de otros materiales biológicos indican que se requiere M1RNA para la actividad de la RNasa P. En 1983, Altoman demostró que en presencia de concentraciones más altas de Mg2, el ARNM1 por sí solo podía catalizar la maduración de los precursores del ARNt, pero la proteína por sí sola no tenía esta capacidad. De esta forma, el ARN puede considerarse una enzima. De hecho, la actividad enzimática del ARNM1 no es menor que la de la RNasa P cruda. Originalmente se pensaba que las proteínas confieren actividad enzimática y que el ARN solo desempeña un cierto papel de apoyo (como ayudar a la proteína a unirse a su sustrato), pero ahora se ha descubierto que estas dos funciones se han invertido. Cech nombró ribozima de ARN catalíticamente activa.
Durante mucho tiempo, la gente ha intentado diseñar y producir moléculas de enzimas por sí mismas, pero debido a la complejidad de la estructura molecular de las proteínas, hasta ahora no ha habido ningún ejemplo exitoso. En los últimos años, con el descubrimiento de la ribozima, han surgido nuevas esperanzas en el diseño de enzimas artificiales (enzimas bajo un nuevo concepto, cuyos componentes básicos son los nucleótidos). Los científicos australianos han diseñado nueve moléculas de ribozimas, todas las cuales tienen actividad endonucleasa y son altamente específicas en sus sitios de escisión. Al mismo tiempo, la actividad de la ribozima cambia con los cambios de pH, temperatura y concentración de cationes, mostrando características enzimáticas típicas. Debido a que el sitio de acción de la ribozima es altamente específico, se puede utilizar para escindir transcripciones de genes (ARN) específicos. Algunas personas llaman a este efecto de escisión actividad antigénica. Porque el resultado del corte es la destrucción del ARN, es decir, la inhibición de la expresión genética. Esta propiedad nos proporciona una forma factible de llevar a cabo terapias genéticas y virales.
Algunos intrones mitocondriales también son intrones autoempalmados. Los intrones mitocondriales de algunos hongos comunes, como Neurosporacrassa y Saccharomyces cerevisiae, pueden sufrir autoempalme, al igual que la reacción de transferencia de fosfato en Tetrahymena. Las uniones de empalme se refieren a las secuencias a ambos lados de los sitios de escisión y reunión. El punto de conexión en el lado izquierdo del intrón se llama donante y el punto de conexión en el lado derecho del intrón se llama aceptor. Todos los intrones de genes estructurales del núcleo (es decir, genes que codifican polipéptidos) tienen GU en las uniones exón-intrón. ..Los *** de AG están en el mismo orden. La secuencia de homología más detallada es la siguiente, sitio donante y sitio aceptor:
Exón...AG↓GUAAGT...Intrón...Py10CAG↓...Exón Sub
Flechas indican vínculos rotos. Estas también son secuencias homólogas más cortas que se encuentran en casi todos los eucariotas.
De la secuencia homogénea anterior, se puede observar que no existe complementariedad entre los sitios donante y aceptor, por lo que es imposible imaginar que estos dos sitios se combinen mediante emparejamiento de bases para facilitar la síntesis interna. Eliminación de intrones. El empalme correcto depende de la integridad de la molécula de ARN precursora nativa. Un gen extraño todavía se puede empalmar bien si está presente en la secuencia viral. Además, el ARN precursor también se puede empalmar correctamente en diferentes tejidos, o incluso en células de diferentes especies. Esto indica que el empalme es muy conservador. Un exón de un gen real se puede conectar a un exón de otro gen.
Por ejemplo, al vincular el primer exón de la unidad de transcripción temprana de SV40 (virus de simio 40) con el tercer exón de la β-globina de ratón, el intrón híbrido resultante aún se puede empalmar correctamente. Es decir, el sitio donante (II) del intrón de SV40 se puede empalmar al sitio aceptor (r2) del intrón de β-globina de ratón. Los extractos nucleares de células HeLa pudieron unir precursores de ARN purificados, lo que indica que el empalme no está acoplado a la transcripción. Las modificaciones del ARN también son independientes del empalme. Por ejemplo, los ARN de globina todavía se pueden empalmar normalmente incluso si carecen de la cadena de cola poli(A) y no están protegidos. El proceso de empalme se puede dividir en dos etapas. A diferencia del autoempalme mencionado anteriormente, que no requiere energía, el empalme intranuclear requiere ATP.
En la primera etapa, se corta el extremo izquierdo del intrón (sitio donante), formando dos moléculas de ARN separadas, el exón izquierdo y el intrón-exón derecho. El exón izquierdo es una molécula lineal en este momento, pero el intrón-exón derecho no lo es: el extremo izquierdo (extremo 5') del intrón está conectado al extremo derecho del intrón aproximadamente 30 bases aguas arriba por un extremo 5'-2. ' enlace La A en la secuencia CUGAC (***secuencia idéntica) en El intrón se poda al mismo tiempo, el exón derecho separado se conecta al exón izquierdo. Luego, el lazo se "desramifica" para formar un intrón lineal. Se ha demostrado en levaduras que una secuencia homóloga corta, es decir, una secuencia en la que los sitios donante y aceptor están en uno y la rama de lazo, si la secuencia homóloga en la rama está mutada o eliminada, no se puede producir el empalme. Esta secuencia homóloga a menudo se denomina caja UACUAAC. Es complementaria a la secuencia homóloga del sitio donante de la izquierda, pero los estudios han demostrado que las dos no contienen pares de bases en las células eucariotas superiores. Hay muchos ARN pequeños en el núcleo y el citoplasma. Tienen alrededor de 100 a 300 bases, y cada célula puede contener entre 105 y 106 moléculas de ARN sintetizadas por la ARN polimerasa II o III, algunas de ellas pueden estar protegidas como ARNm. El núcleo se llama snRNA, mientras que los del citoplasma se llaman scRNA, pero en su estado natural ambos son similares. Las proteínas están combinadas, por lo que se llaman snRNP y scRNP respectivamente. Algunos snRNP están estrechamente relacionados con el empalme. Algunos snRNP son complementarios. a los sitios de empalme donante y aceptor y a las secuencias de rama. La más interesante es la U1. Se encuentra comúnmente en células de mamíferos, aves e insectos. Además del ARN, el U1snRNP humano también contiene 8 moléculas de proteína. Como se muestra en la figura, los 11 nucleótidos en el extremo 5' son monocatenarios y hay una secuencia complementaria a la secuencia donante en el lado izquierdo del intrón. La secuencia complementaria en el sitio donante suele ser de 4 a 6 pb. In vitro, la partícula U1snRNP completa puede unirse al lado izquierdo en la misma secuencia, pero la U1snRNA purificada no. La evidencia de que U1snRNA participa en el empalme es que los anticuerpos contra U1snRNP pueden inhibir el empalme in vitro y si se elimina U1snRNP. del sistema, el empalme no puede realizarse, de hecho, simplemente eliminando algunos nucleótidos en el extremo 5' del ARN U1sn. Inhibir el empalme in vitro.
Es posible que el ARNn U5 reconozca la misma secuencia en el. lado derecho (sitio aceptor), mientras que U2snRNA tiene una secuencia complementaria al sitio de rama y el anticuerpo contra U2snRNP puede unirse a él. El complejo formado por U2 snRNA y el intrón que incluye el sitio de rama está inmunoprecipitado. la etapa inicial de la reacción de empalme, porque la inactivación de U1 y U2 evitará la escisión y el corte de la unión izquierda. Otros dos snRNAsn (U4 y U6) también pueden estar involucrados en el empalme, pero se desconocen sus funciones. Generalmente se cree que las células de los vertebrados tienen 6 snRNA diferentes, llamados U1, U2, U3, U4, U5 y U6. El más pequeño es el U6, que tiene unos 100 nucleótidos de largo. El más grande es el U3, que tiene sólo 215 nucleótidos de largo.
Se combinan con proteínas para formar snRNP. Los autoanticuerpos contra ciertas proteínas en snRNP a menudo se pueden detectar en el suero de pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) y algunas enfermedades reumáticas. Por ejemplo: la secuencia de ADN de la región codificante de la proteína del ARNm de la apolipoproteína de los mamíferos es la misma en todos los tejidos del hígado, el gen se transcribe en una proteína completa, mientras que la Pr sintetizada en el intestino tiene solo la mitad de su longitud (solo la mitad); proteína completa). apolipoproteína larga) debido a una mutación del codón en la posición 2153 de CAA a UAA (cambiando el codón que codifica la glutamina a un codón de parada). También hay un ejemplo de ARNm de la proteína del receptor de glutamato en el cerebro de rata. Después de la edición, múltiples codones que codifican el glutamato en la molécula se convirtieron en los que desempeñan un papel importante en el control del flujo de iones a través de los neurotransmisores, lo que indica que la edición del ARN puede ser necesaria. función fisiológica completa.
Las dos situaciones anteriores son catalizadas por la citosina y la adenina desaminasa respectivamente; por lo general, la especificidad de esta reacción enzimática no es fuerte y la adenina desaminasa puede actuar sobre cualquier región de ARN bicatenario; La edición de ARN se produce en un complejo con una subunidad de desaminasa catalítica, con dominios de unión a ARN adicionales que ayudan a identificar el sitio objetivo específico que se está editando. ARN guía: La información para la inserción específica de estos residuos proviene de que contiene una secuencia de nucleótidos complementaria al ARNm editado. Aunque el ARN guía tiene un grado considerable de complementariedad con la región editada y las secuencias de ácido nucleico circundantes, hay algo de adenina. lin no logra emparejarse, formando una mella que proporciona una plantilla para la inserción de uracilo.
La edición de ARN tiene un importante significado biológico:
Corrección; regulación de la traducción; ampliación de la información genética