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Descripción general de la investigación sobre el cultivo de tejidos vegetales y sus aplicaciones
Con los continuos esfuerzos de científicos de todo el mundo, la tecnología del cultivo de tejidos vegetales se ha desarrollado rápidamente en las últimas décadas. Mediante el cultivo de tejidos, no sólo podemos producir en masa clones excelentes y obtener una variedad de sustancias metabólicas necesarias para los humanos, sino también obtener haploides, triploides, poliploides y aneuploides. La fusión celular puede romper los límites entre especies y superar la incompatibilidad de híbridos distantes, desempeñando un papel enorme en el cultivo de nuevas variedades de plantas y la mejora de especies. Las células vegetales cultivadas con tejidos son materiales ideales para el análisis y la investigación a nivel celular, desde la rápida propagación de plantas y el cultivo de anteras hasta el cultivo de orgánulos, la fusión de protoplasma y la tecnología de recombinación de ADN, la tecnología de cultivo de tejidos vegetales se utiliza ampliamente en diversos campos de la ciencia vegetal y la agricultura. , silvicultura, industria, medicina y otras industrias, se ha convertido en la disciplina más vital de las ciencias biológicas contemporáneas.
1 Conceptos básicos, principios y procedimientos experimentales del cultivo de tejidos vegetales
1.1 Concepto
El cultivo de tejidos vegetales es el proceso de cultivo in vitro de plantas en condiciones estériles. Se cultivan órganos (puntas de raíces, puntas de brotes, etc.), tejidos (cambium, tejidos de anteras, etc.), células (células somáticas, células germinales, etc.), embriones (embriones maduros o inmaduros), protoplastos, etc. Preparaciones artificiales El cultivo sobre sustrato es una tecnología que proporciona condiciones de cultivo apropiadas e induce la producción de callos o yemas latentes o el crecimiento de plantas completas.
1.2 Principio
La base del cultivo de tejidos vegetales es la "totipotencia" de las células vegetales y la "regeneración" de las plantas. En 1902, el famoso botánico alemán G. Haberlandt propuso un punto de vista basado en la teoría celular: "Los órganos y tejidos de las plantas superiores pueden dividirse continuamente hasta formar una sola célula, es decir, una célula somática vegetal. Las células somáticas tienen el potencial de dividirse, reproducirse y desarrollarse continuamente en una planta completa bajo condiciones apropiadas." En 1943, American White descubrió accidentalmente la formación de una yema en un callo de tabaco, confirmando que G. El argumento de Haberlandt.
Diferentes plantas requieren diferentes condiciones de crecimiento y utilizan diferentes medios de cultivo. Los medios básicos más utilizados incluyen MT, MS, SH, N6, White, etc. En el cultivo de tejidos, la clave para cultivar nuevas plantas es si se pueden formar callos y cuerpos embrioides. Añadiendo una cierta concentración de hormonas exógenas al medio básico, se pueden inducir callos, cuerpos embrioides, brotes adventicios, raíces y otros órganos, y finalmente se pueden obtener plantas regeneradas o materia secundaria.
Los materiales utilizados para el cultivo de tejidos vegetales se denominan explantes, y sus formas principales incluyen órganos, embriones, células individuales, protoplastos, etc. Dependiendo del explante, el tipo de medio de cultivo, las condiciones de cultivo, el tipo y la proporción de hormonas exógenas necesarias son diferentes. En el cultivo de tejidos vegetales, existen muchos factores que afectan la cultivabilidad. La clave para el éxito o el fracaso de la inducción de callos radica en las condiciones de cultivo. Las fitohormonas son los factores clave para inducir la diferenciación de callos y plántulas verdes.
Las auxinas más utilizadas para la inducción de callos son IAA, NAA y 2,4-D, y la concentración requerida es O. 01~10 mg/L. Las citoquininas más utilizadas son KT y ABA, y la concentración utilizada es O. 1~10 mg/L. La función principal de KT es promover la división celular y la diferenciación de callos. ABA juega un papel importante en la aparición y desarrollo de embriones somáticos de plantas. Aunque los efectos fisiológicos de varios tipos de hormonas vegetales son relativamente específicos, los diversos efectos fisiológicos de las plantas son una manifestación integral de la interacción entre diferentes tipos de hormonas.
1.3 Pasos de la prueba
1.3.1 Selección y preparación del medio de cultivo El medio de cultivo es la "sangre" en el cultivo de tejidos vegetales, y la composición de la sangre está directamente relacionada con su Estado de suministro. Para el crecimiento y diferenciación de los cultivos, es importante comprender la composición, características y preparación del medio de cultivo.
1.3.2 Esterilización La esterilización es una de las tareas importantes en el cultivo de tejidos, y generalmente se utilizan métodos de esterilización física o química. El medio de cultivo debe esterilizarse mediante calor húmedo, como presión normal o cocción a alta presión, los instrumentos deben esterilizarse mediante quemado, la cristalería y los utensilios resistentes al calor deben esterilizarse mediante calor seco, los materiales termolábiles deben esterilizarse mediante filtración. y la superficie de los materiales vegetales debe esterilizarse con desinfectantes, las superficies de los objetos se esterilizan mediante pulverización química y los espacios como las salas de inoculación se esterilizan mediante rayos ultravioleta o fumigación.
1.3.3 Inoculación: Cortar o recortar las raíces, tallos, hojas y otros órganos aislados esterilizados en pequeñas secciones o trozos y colocarlos en el medio de cultivo. Todo el proceso de inoculación debe realizarse en condiciones estériles. Continúe a continuación.
l.3.4 Cultivo: Colocar los materiales de cultivo en una sala de cultivo con ciertas condiciones de luz y temperatura para permitirles crecer, dividirse y diferenciarse para formar callos o diferenciarse aún más en plantas regeneradas.
1.3.5 Domesticación y trasplante de plántulas de probeta. Las plántulas de probeta son plántulas que crecen en condiciones ambientales especiales. Son muy diferentes de las plántulas de crecimiento natural. Sólo mediante la domesticación y la adaptación al entorno natural pueden lograrse. ser cultivado.
2 Aplicación del cultivo de tejidos vegetales
2.1 Propagación rápida de plantas y producción de plántulas sin virus
La tecnología de propagación rápida de plantas comenzó en la década de 1960 y tuvo éxito en Morel de Francia. en la propagación de orquídeas en grandes cantidades mediante el cultivo de puntas de tallos, lo que abrió el preludio a la investigación y aplicación de tecnología de propagación rápida de plantas. En la actualidad, hay más de 1.000 especies de plantas de más de 100 familias que pueden obtenerse plantas pequeñas mediante cultivo in vitro y tienen potencial para una reproducción rápida, y algunas se han convertido en productos de producción industrial. Del 80% al 85% de las orquídeas del mundo se desintoxican y se propagan rápidamente mediante cultivo de tejidos. Los tipos de plantas cultivadas también han evolucionado gradualmente desde plantas ornamentales hasta plantas hortícolas, cultivos extensivos, plantas económicas y plantas medicinales. En nuestro país, investigaciones similares se iniciaron en la década de 1970. Se han plantado a gran escala semillas de papa no tóxicas y plántulas de caña de azúcar, y se han puesto en producción a gran escala o en ensayos piloto más de 30 especies de plantas. El uso del cultivo de tejidos para la rápida propagación de plantas y la producción de plántulas libres de virus no sólo puede salvar especies preciosas y en peligro de extinción, sino también resolver el problema de la falta de recursos de plantas silvestres.
2.2 Cultivo de anteras de plantas y mejoramiento de haploides
Al cultivar anteras de plantas en plantas haploides y luego duplicar los cromosomas, se pueden obtener rápidamente diploides homocigotos, lo que acortará en gran medida los años de reproducción. . Hasta ahora se han obtenido plantas haploides de cientos de plantas en el mundo a través del cultivo de polen y anteras. Las líneas de arroz desarrolladas por científicos indios que utilizan este método tienen un aumento de rendimiento del 15% al 49% en comparación con el control. Corea del Sur ha desarrollado cinco variedades de arroz de alta calidad, resistentes a enfermedades y al acame. Desde que mi país inició las investigaciones en este campo en la década de 1970, ha cultivado más de 40 tipos de plantas haploides desarrolladas a partir de polen o anteras, de las cuales más de 10 son las primeras de su tipo en mi país. Se han obtenido más de 100 líneas endogámicas homocigotas para el maíz; se han obtenido plantas diploides y triploides para el caucho. Sólo durante el período del Noveno Plan Quinquenal, se desarrollaron 44 nuevas variedades de cultivos con alto rendimiento, alta calidad, resistencia al estrés y a las enfermedades, con una superficie de plantación de más de 6,6 millones de hectáreas.
2.3 Cultivo de embriones de plantas
En el mejoramiento de híbridos, los embriones híbridos a menudo son abortados. Por lo tanto, es posible cultivar plantas híbridas extrayendo embriones de crecimiento temprano y aplicando métodos de cultivo de tejidos. . Ha habido más de 100 informes sobre el cultivo de embriones inmaduros en plantas. Científicos nacionales y extranjeros han aplicado tecnología de cultivo de embriones de plantas para obtener una variedad de recombinantes, cultivares y variedades híbridas distantes.
2.4 Cultivo de callos vegetales o suspensión celular
El cultivo de callos vegetales o suspensión celular se puede utilizar para producir metabolitos secundarios de plantas para la prevención y el tratamiento de enfermedades. En los últimos años, este campo se ha desarrollado extremadamente rápido. Se han estudiado más de 400 tipos de plantas y se han aislado más de 600 tipos de metabolitos secundarios de células cultivadas, de los cuales más de 60 tipos superan o igualan el contenido de. las plantas originales y se han aislado más de 20 tipos de células madre. Pesa 1,9,6 veces más que la planta original. Por ejemplo, la diosgenina producida a partir de callos de ñame y células en suspensión se utiliza en la síntesis de fármacos esteroides. Recientemente, el cultivo de células de tejo paclitaxel, un fármaco anticancerígeno, se puede cultivar en un tanque de fermentación de 75 toneladas y ha alcanzado el nivel de producción comercial. Además, la consuelda, el ginseng, el coptis, el geranio, etc. han alcanzado el nivel de comercialización; la vinca, la dedalera, el tabaco, etc. han alcanzado la producción industrial, más de 20 plantas como el palillo y el cártamo se encuentran en transición a la comercialización.
2.5 Fusión celular y cultivo de protoplastos
Desde que el académico británico Cocking logró por primera vez utilizar la celulasa para aislar protoplastos de las raíces de plántulas de tomate en 1960, en 1990 existen más de 100 especies. de plantas cuyos protoplastos pueden regenerar plantas. Nuestro país ha obtenido más de 30 variedades de plantas regeneradas con protoplastos, incluidos importantes cultivos alimentarios y comerciales de difícil producción, como soja, arroz, maíz, trigo, mijo, sorgo, algodón, etc.
También ha sido rápido el progreso en el cultivo de protoplastos de plantas leñosas, plantas medicinales, hortalizas y hongos. En el extranjero se han obtenido plantas híbridas de células somáticas intraespecíficas e interespecíficas. El cultivo de protoplastos vegetales también se puede utilizar en investigaciones sobre transferencia de genes exógenos, variación clonal y detección de mutantes, por lo que ha atraído cada vez más atención.
2.6 Selección de mutantes de células vegetales
La selección de mutantes de células vegetales comenzó en 1959, G. Melchers obtuvo mutantes de temperatura en cultivos de células en suspensión de boca de dragón. En 1970, p. S. Carlson, H. Encuadernación e Y. METRO. Heimer et al. aislaron células auxotróficas del tabaco, líneas celulares resistentes a la estreptomicina de petunia y líneas celulares resistentes a la treonina del tabaco. Hasta la fecha, se han analizado más de 100 mutantes o variantes de células vegetales en cultivos de células vegetales de no menos de 15 familias y 45 especies. Estos incluyen mutantes celulares resistentes a enfermedades, como la resistencia del maíz a los mutantes de la enfermedad de las manchas pequeñas y los mutantes de resistencia a la sarna del trigo y la pudrición de la raíz; para estresar, tales como mutantes tolerantes a la sal de arroz y mutantes resistentes a la sal de trigo; mutantes de células resistentes a herbicidas y mutantes de células auxotróficas, tales como mutantes de maíz resistentes a herbicidas, tales como mutantes enanos de arroz;
2.7 Embriones somáticos de plantas y semillas artificiales
En 1958, Reinert descubrió por primera vez embriones somáticos (cuerpos embrioides) en cultivos de tejidos de zanahorias. Según estadísticas incompletas, existen más de 100 especies de plantas en 92 géneros y 43 familias que pueden producir cuerpos embrioides en grandes cantidades. Algunos cultivos importantes, como el arroz, el trigo, el maíz, el mijo perla, etc., también pueden producir cuerpos embrioides mediante cultivo in vitro. Estos cuerpos embrioides se embeben con alginato de sodio, etc., y luego se acoplan con una cubierta de semilla artificial para formar semillas artificiales. Las ventajas de las semillas artificiales son: una reproducción rápida y una tasa de plántula extremadamente alta; no se ven afectadas por el clima y pueden producirse en fábricas en todas las estaciones. A principios de la década de 1980, Estados Unidos, Japón, Francia y otros países llevaron a cabo sucesivamente investigaciones sobre semillas artificiales. Mi país también llevó a cabo esta investigación durante el "Séptimo Plan Quinquenal" y se incluyó en el alto nivel nacional "863". Investigación y desarrollo tecnológico en 1987. Plan.
2.8 Criopreservación de cultivos de células de tejidos vegetales y establecimiento de un banco de germoplasma
El descubrimiento y confirmación de la totipotencia de las células vegetales ha abierto un camino para la preservación a largo plazo de los recursos de germoplasma vegetal. Nuevas formas. El uso de tecnología de preservación a temperatura ultrabaja con nitrógeno líquido puede mantener una alta tasa de supervivencia, regenerar nuevas plantas y mantener las características genéticas originales. Por ejemplo, el establecimiento de un banco de germoplasma para criopreservación de cultivos de meristemas del ápice de los brotes no sólo puede prevenir la variación genética y la degradación del germoplasma, sino también preservar las especies originales libres de virus durante mucho tiempo.
2.9 Aplicación del cultivo de tejidos vegetales y tecnología transgénica
La construcción e investigación de la primera biblioteca de mutantes de inserción de ADN T de mi país ha sentado una buena base para la investigación de la genómica funcional del arroz en mi país. La base tecnológica y material ha hecho contribuciones positivas para garantizar que nuestro país tenga un lote de recursos genéticos con derechos de propiedad intelectual independientes. En cooperación con el Laboratorio Abierto Clave de Biología del Arroz del Ministerio de Agricultura del Instituto de Investigación del Arroz de China y el Instituto de Fisiología Vegetal de Shanghai de la Academia de Ciencias de China, se estableció un sistema de tecnología transgénica mediada por Agrobacterium eficiente y a gran escala para convertir transposones exógenos de maíz Ac-D en genes. Se introdujeron genes en embriones de arroz inmaduros y callos inducidos por semillas, se obtuvieron 12.000 líneas de inserción de ADN-T independientes y se construyó una base de datos de mutantes de arroz.
3 Perspectivas
La investigación y aplicación del cultivo de tejidos vegetales es uno de los principales logros del progreso científico y tecnológico del siglo XX y proporciona una base para estudiar el crecimiento y el desarrollo de las plantas. , la fisiología de la resistencia, las hormonas, la organogénesis y la embriogénesis, etc. proporcionaron muchos buenos materiales experimentales y formas efectivas. A medida que los métodos de cultivo de tejidos vegetales continúan mejorando, su ámbito de aplicación también se ha ampliado en consecuencia. Debido a que el cultivo de tejidos se lleva a cabo en condiciones controladas artificialmente, es fácil comprender la diferenciación de los botones florales y las causas de la floración a través del cultivo de embriones, se pueden obtener híbridos o endogámicos aislando células haploides, se pueden cultivar líneas excelentes diploides homocigotas; mejorar la diversidad reproductiva también acorta el tiempo de reproducción; mediante la detección de mutantes, se mejora la calidad de las plantas, se mejora la capacidad de resistir el estrés y se amplía el rango de crecimiento de las células somáticas a bajas temperaturas para establecer bancos de genes; lograr el propósito de preservar especies; la obtención de productos secundarios con alto valor medicinal y necesarios para la producción industrial acelera el tiempo de producción de medicamentos y reduce la pasividad de depender únicamente de plantas naturales.
La tecnología del cultivo de tejidos vegetales ha penetrado en todos los campos de la investigación científica, la producción y la vida, y seguramente mejorará día a día.
Ciencias Agrícolas de Heilongjiang 2006, (3)