La Red de Conocimientos Pedagógicos - Aprendizaje de inglés - ¿Cuáles son los vectores de transcripción in vitro (con promotor T7) comúnmente utilizados? Expresar el gen diana en E. coli es un método cómodo y rápido para obtener grandes cantidades de proteínas recombinantes. El gen diana clonado en la planta se clona en un vector plásmido especialmente diseñado, que está controlado por el fuerte promotor del bacteriófago T7. La expresión es inducida por la ARN polimerasa T7 proporcionada por la célula huésped. Cuando es necesario expresar una proteína, se agrega IPTG al medio de cultivo bacteriano para iniciar la expresión. Diferentes vectores tienen secuencias que codifican diferentes "etiquetas" polipeptídicas cerca del sitio de clonación, lo que facilita la localización, detección o purificación de la proteína diana. Este artículo toma pET-32a( ) como ejemplo para introducir el proceso de clonación del gen diana en un vector para expresión y obtención de proteína recombinante, de modo que puedas familiarizarte con todo el proceso de expresión procariótica utilizando diferentes vectores según el tuyo. requisitos. 1. Preparación (configuración de reactivos y preparación de equipos) 1) Diagrama de flujo de operación. Pasos principales: ① Preparación del vector pET-32a (), digestión con endonucleasa de restricción, purificación en gel y recuperación después de la desfosforilación ② Preparación del plásmido de carga de PCR de ADN insertado, digestión con endonucleasa de restricción y recuperación ③ Insertar El fragmento se clona en el pET-32a ( ) vector, ligado con pET y transformado 4. Transformar la cepa huésped BL21 en una cepa con el gen de la ARN polimerasa T7. 5. Inducir la expresión de la proteína diana mediante transferencia Western SDS y el análisis cuantitativo confirma la amplificación. proteína objetivo. Experimente para purificar la proteína objetivo, prepare el extracto crudo, purifique por afinidad y corte la etiqueta de fusión. 2) Prepare un medio de crecimiento como LB e IPTG 100 mM, solución madre de kanamicina 50 μg/ml. 3) Preservación de las bacterias huésped. Las cepas y los recombinantes de pET para almacenamiento a largo plazo deben almacenarse en glicerol. 4) En cuanto a la preparación de células competentes, consulte otros manuales de prueba. 2. Pasos de la operación [1] Preparación del vector 1) Digestión del vector y purificación en gel 3 μg de vector pET 3 μl 10 × tampón de enzima de restricción 10-20 U (ya sea * * * con tampón; el volumen de enzima no debe exceder el sistema de reacción 65,438 00) 3 l de 65,438 0 mg/ml de acetil BSA (agregue agua a 30 l según sea necesario), incube a 37 °C durante 2-4 h 3), tome 3 l de muestra para electroforesis y detecte el progreso de la reacción de digestión. 4) Después de la digestión completa, agregue 0,05 U de fosfatasa alcalina de ternera e incube a 37 °C durante 30 minutos. 5) Incube todas las muestras a 65 °C, 440 °C. 6) Guárdelas a -20 °C para su uso posterior. [2] Preparación de insertos La digestión de restricción y la purificación en gel son métodos comunes para preparar insertos. Por lo general, el gen diana con sitios de restricción se amplifica mediante PCR y se clona en un vector T, y luego se digiere y se recupera en gel mediante la misma endonucleasa utilizada para digerir el vector. Sin embargo, durante el proceso de PCR, es necesario reducir la aparición de mutaciones. Se pueden utilizar enzimas de alta fidelidad para minimizar el número de ciclos de PCR y aumentar la concentración de plantillas y cebadores. [3] Reacción de ligadura del fragmento de inserción 2 µl de tampón de ligación 10X 2-5 µl 50 ng/μl de vector pET32a prefabricado 1 µl de ligasa T4 5-7 µl de fragmento de inserción del gen objetivo prefabricado Agregue agua a 20 µl y mezcle uniformemente. Reacción a 16°C durante 2 horas hasta toda la noche [4] El método de transformación es el mismo que el de la transformación del vector T de E. coli DH5α. Se pueden transformar tanto BL21 como DH5α. Si transforma DH5α, debe volver a extraer el plásmido y luego transformarlo en BL21. Las placas de detección LB deben contener 50 µg/µl de kanamicina. [Si la subclonación tiene éxito en la identificación de PET recombinantes, el número de colonias positivas será mucho mayor que el número de colonias negativas. Existen muchos métodos para probar transformantes, incluida la PCR, la extracción de plásmidos, el análisis de digestión, la secuenciación, la transcripción in vitro y la traducción. [6] Inducir la expresión de lisozima DE3 (1), seleccionar un único clon de una placa de estrías nueva, inocularlo en 50 ml de medio líquido que contenga 50 μg/μl de kanamicina y cultivar a 37 °C hasta que la DO600 sea 0,4-1. . (2) Agregue 100 mMIPTG al medio de cultivo hasta que la concentración final sea 0,4 mM (promotor T7) o 1 mm (promotor T7) y continúe cultivando durante 2-3 horas. (3) Coloque el matraz de agitación en hielo durante 5 minutos y centrifugue a 5000 g durante 5 minutos a 4 °C para recolectar las bacterias.