Describir los procedimientos de prueba para Mycobacterium tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae son las principales bacterias patógenas del género Mycobacterium.

Las células de Mycobacterium tuberculosis son delgadas y ligeramente curvadas, con tendencia a ramificarse. El alto contenido de lípidos de la bacteria está estrechamente relacionado con su resistencia a los ácidos, resistencia, patogenicidad e inmunidad. Esta bacteria tiene altos requerimientos nutricionales y crece lentamente, formando colonias "parecidas a la coliflor".

1. Procedimientos de prueba de Mycobacterium tuberculosis

La detección de Mycobacterium tuberculosis en las lesiones de pacientes con tuberculosis es una base importante para el diagnóstico etiológico según el sitio de la infección, el esputo y la orina del paciente. y Las heces, el líquido cefalorraquídeo, el líquido torácico y ascítico, el jugo gástrico, etc. se analizan de acuerdo con los siguientes procedimientos.

2. Características del cultivo de Mycobacterium tuberculosis

1. Rendimiento del crecimiento de Mycobacterium tuberculosis en medio de cultivo líquido (medio de Sutong, medio de Ogawa, medio ácido sérico, etc.): Los materiales de las muestras fueron Después del pretratamiento (es decir, tratamiento ácido-base, que puede licuar la muestra, matar bacterias diversas y concentrar bacterias), el medio líquido se inocula y se cultiva a 35 °C durante 1 a 2 semanas. Se pueden formar bacterias en la superficie del medio. Biopelícula polvorienta, seca y arrugada.

2. Rendimiento del crecimiento de Mycobacterium tuberculosis en medios sólidos (medio de Roche modificado, medio de piruvato de sodio, etc.): Después del pretratamiento de los materiales de la muestra, inocular el medio sólido y cultivar a 37°C durante 2-4 semanas, se pueden formar colonias granulares o nodulares opacas, de color blanco lechoso o beige, que muestran una apariencia de "coliflor".

3. Método rápido de cultivo y detección de Mycobacterium tuberculosis: Procedimiento aséptico, untar el material pretratado, colocarlo en un medio de cultivo líquido y cultivarlo en una incubadora de CO2 a 35°C después de 3. -5 días. Saque un portaobjetos cada dos días y tíñelo bajo un microscopio para obtener resultados rápidamente.

3. Método de tinción ácido-alcohol resistente de Ziehl-Neelsen

Principio

Mycobacterium tuberculosis no es fácil de teñir con tintes de anilina si el teñido se calienta o se prolonga. Después de colorearlo durante mucho tiempo, no es fácil decolorar cuando se trata con alcohol de ácido clorhídrico 3. Después de teñir con azul de metileno, Mycobacterium tuberculosis y otras micobacterias todavía aparecen rojas, mientras que las bacterias no resistentes al ácido y las impurezas celulares aparecen azules. .

Materiales

1. Esputo de pacientes tuberculosos: Tomar el primer bocado de esputo pegajoso de la mañana, o muestras de esputo procesadas por el método colonial concentrado.

2. Solución de tinción acidorresistente

3. Portaobjetos, portaobjetos, lámparas de alcohol, crayones, etc.

Métodos

1. Los procedimientos asépticos incluyen tomar frotis de esputo, secarlos de forma natural y fijarlos con una llama.

2. Utilice un crayón para separar parcialmente la superficie pintada, agregue gota a gota tinte fucsina de ácido carbólico y caliéntelo sobre una lámpara de alcohol hasta que aparezca vapor. No hierva ni permita que la solución de tinte se seque. Si hay tendencia a secarse, la solución de tinte debe reponerse a tiempo. Continúe teñiendo durante 5 a 8 minutos, luego enjuague el exceso de tinte líquido con agua corriente después de enfriar.

3. Utilice alcohol de ácido clorhídrico 3 para decolorar hasta que la superficie pintada quede incolora, durante aproximadamente 1-3 minutos, enjuague con agua del grifo.

4. Añade la solución de teñido Meilan de Lu gota a gota durante 30 segundos a 1 minuto y lava con agua. Seque naturalmente o seque y luego inspeccione con un microscopio de aceite.

Resultados

1. Mycobacterium tuberculosis se presenta como glóbulos rojos delgados y ligeramente curvados, algunos con características ramificadas y otros con numerosas partículas densamente teñidas. Mycobacterium tuberculosis está dispuesto en su mayor parte de forma dispersa y también se pueden observar disposiciones longitudinales en forma de cordón.

2. Para aquellos cuyo Mycobacterium tuberculosis puede detectarse mediante tinción de frotis, el número de bacterias en el esputo generalmente debe ser de al menos 500 o más, o incluso más de 50.000 por mililitro de esputo. Por lo tanto, los materiales a menudo se concentran y recolectan para aumentar la tasa positiva de detección. Esto también resulta en el hecho de que Mycobacterium tuberculosis puede no ser visible en todos los campos de visión durante la observación de muestras teñidas.

3. Mycobacterium tuberculosis es propenso a mutar en medios de cultivo antiguos o materiales de muestra después del tratamiento clínico, Mycobacterium tuberculosis a menudo se rompe o forma partículas esféricas o cortas grampositivas no resistentes al ácido. También conocidas como partículas de muchas.

4. La muestra ha sido esterilizada mediante alta presión, lo que no afecta los resultados de la tinción y garantiza la seguridad del operador.

4. Método de tinción fluorescente

Este método utiliza auramina fluoresceína para teñir bacterias que expanden el ácido. Es simple y fácil de realizar, pero no es específico. Existen muchos métodos de tinción de auramina, que se enumeran en la siguiente tabla. Puede optar por utilizarlos y comprobar los resultados con un microscopio de fluorescencia.

5. Prueba de virulencia de Mycobacterium tuberculosis - método de experimentación con animales

Materiales

1. Animales: 2 cobayas que pesen entre 200 y 250 gramos

2. Cultivo de Mycobacterium tuberculosis o materiales de prueba de pacientes con tuberculosis (esputo, orina, heces, ascitis y otros materiales concentrados para recolectar bacterias)

3. Jeringas y materiales de desinfección, etc.

Método

1. Seleccionar dos cobayas con prueba de tuberculina negativa.

2. Aspire la suspensión de Mycobacterium tuberculosis o la muestra del paciente e inyecte 0,1 ml por vía subcutánea en la ingle de la cobaya.

3. Compruebe periódicamente una vez a la semana después de la inyección para observar si la ingle de la cobaya Los ganglios linfáticos están inflamados. Los síntomas incluyen endurecimiento local, supuración, pérdida de peso y aumento de la temperatura corporal.

4. Hazle a la cobaya una prueba de tuberculina para ver si hay un resultado positivo.

5. Después de 6 semanas, diseccione la cobaya y observe si los ganglios linfáticos están inflamados, si hay lesiones caseosas, si el hígado, el bazo, los pulmones, etc. están agrandados, si hay manchas grises. Lesiones nodulares blancas en la superficie y sospechosas. Las lesiones se sometieron a microscopía de tinción y aislamiento y cultivo. Si el resultado es positivo, se puede informar que "se encontró que el animal estaba infectado con la bacteria de la tuberculosis ×× días después de la vacunación". Si no hay síntomas ni lesiones se puede reportar como negativo.

6. Método de concentración de Mycobacterium tuberculosis (tomando como ejemplo el procesamiento de muestras de esputo)

Materiales

Esputo de 24 horas de pacientes con tuberculosis, frasco de boca estrecha, Solución de rojo fenol 0,02, gasolina, NaOH, solución salina estéril, etc.

Método

(1) Método de flotación:

1. Tome 15 ml de esputo durante 24 horas, póngalos en una botella de boca estrecha y agregue 2 veces la cantidad de 0,5 Agitar bien con NaOH y esterilizar en autoclave o hirviendo durante 20-30 minutos.

2. Después de enfriar, añadir 2 ml de gasolina (xileno también es aceptable), agitar vigorosamente durante 20-30 minutos, añadir suero fisiológico hasta que el nivel del líquido esté a la altura de la boca de la botella, y dejar se deja reposar durante media hora.

3. Tome la sustancia aceitosa en la superficie de la boca de la botella y aplíquela en el portaobjetos, caliéntela ligeramente, agréguela después del secado, repita esto 5-6 veces hasta que el espesor sea el adecuado, séquela. y déjelo enfriar, luego tíñelo con inspección de lentes de aceite.

(2) Método de precipitación:

1. Tome 1 parte o 2 veces la cantidad de 4NaOH del esputo, esterilícelo a alta presión o hiérvalo durante 20-30 minutos. luego agregue 0,02 indicador rojo de fenol (0,1 ml), agite vigorosamente para mezclar o colóquelo en un baño de agua a 37 °C para la digestión durante 30 minutos.

2. Corregir el pH a 7,0, centrifugar a 3000 rpm durante 30 minutos y desechar el sobrenadante.

3. Tomar el frotis de sedimento para tinción y examen microscópico. Si se realizan cultivos de aislamiento e inoculación de animales, se pueden omitir los procedimientos de autoclave o ebullición.

Apéndice: Preparación de solución de colorante ácido-alcohol resistente

1. Solución de fucsina de ácido carbólico: Pesar 4 gramos de solución básica de fucsina y disolverla en 100 ml de alcohol 95 hasta formar una solución saturada. solución. Luego tome 10 ml de solución saturada y 90 ml de solución de ácido carbólico 5 y mezcle bien.

2.3 Alcohol ácido clorhídrico: Tomar 3 ml de ácido clorhídrico concentrado, 95 ml de alcohol y mezclarlo con 97 ml.

3. Solución alcalina de melanina de Loeffler: Pesar 2 gramos de melanina, disolverlos en 100 ml de alcohol 95 y preparar una solución saturada. Tomar 30 ml de la solución saturada y luego añadir 100 ml de destilado. agua y 0,1 ml de solución acuosa de hidróxido de potasio 10 están listos.