¿Cuál es el principio del espectrofotómetro?

En un espectrofotómetro, cuando se irradia continuamente luz de diferentes longitudes de onda a una solución de muestra de una determinada concentración, se puede obtener la intensidad de absorción correspondiente a las diferentes longitudes de onda, tomando por ejemplo la longitud de onda (λ). la coordenada horizontal, la intensidad de absorción (A) es la ordenada y se puede dibujar la curva del espectro de absorción de la sustancia. El método de utilizar esta curva para realizar análisis cualitativos y cuantitativos de sustancias se llama espectrofotometría, también llamada espectroscopia de absorción. fuente de luz ultravioleta El método para medir sustancias incoloras se llama espectrofotometría ultravioleta; el método para medir sustancias coloreadas utilizando fuentes de luz visible se llama fotometría de luz visible. Al igual que el método colorimétrico, todos se basan en la ley de Beer-Lambert.

En los últimos años, el análisis espectrofotométrico de luz ultravioleta y visible se ha utilizado ampliamente. No solo se puede utilizar para la identificación y análisis estructural de sustancias, sino que también se puede utilizar para la determinación del contenido de determinadas sustancias.

La tecnología de espectroscopia espectroscópica se puede utilizar para:

Determinar la composición de una sustancia midiendo sus espectros de absorción o emisión.

Determinar la presencia de una sustancia sola o en combinación con otras sustancias midiendo la intensidad de la señal en longitudes de onda apropiadas. El contenido de una sustancia en una mezcla.

Realice un seguimiento del proceso de reacción midiendo la desaparición de un determinado sustrato o la aparición de un producto con el tiempo.

1. La espectrofotometría de luz ultravioleta y visible es una tecnología que solo mide la absorción de radiación por materiales dentro del rango de aplicación del espectro visible y ultravioleta. Se usa ampliamente. El espectrofotómetro se puede utilizar para medir con precisión el valor de absorción de. una longitud de onda específica, mientras que el colorímetro es un instrumento de medición relativamente simple cuyo principio es utilizar un filtro para medir el valor de absorción de una banda más amplia (como el rango verde, rojo o azul de la luz visible).

Ley de absorción de luz:

Hay dos reglas básicas para la absorción de luz por una solución:

El valor de absorción de la luz transmitida a través de la solución está relacionado exponencialmente con la número de moléculas que absorben el soluto (es decir, la concentración de soluto [C]).

El valor de absorción de la luz que pasa a través de una solución está relacionado exponencialmente con la longitud del camino l a través de la solución absorbente.

Estas dos leyes están incluidas en la relación de Beer-Lambert. Generalmente se expresa como La densidad óptica de la luz incidente (Io) y la luz emergente (I) se expresa como:

ε donde ε es una constante. para el material absorbente y la longitud de onda, llamado coeficiente de absorción o coeficiente de absorción, y la unidad de [C] es mol/L o g/L, la unidad de l es ml. Esta fórmula es muy útil porque la mayoría de los espectrofotómetros están diseñados para medir directamente. mida el valor (A) o el valor de extinción (E) de log10 (Io/I) (libro de texto antiguo Un término que puede usarse para abolir: densidad óptica Para sustancias que siguen la relación de Beer-Lambert, A está linealmente relacionado con). C. Los valores de absorción a menudo se representan mediante subíndices de su longitud de onda, como A550, que representa el valor de absorción a 550 nm. A través de la solución, la proporción de luz se llama transmitancia (T), que se puede obtener a partir de la relación de. luz saliente y luz incidente.

Valor de absorción (A) (absorbancia): derivado de la fórmula:

Transmitancia (T) (transmitancia): generalmente expresada como porcentaje: T = (I/Io) × (1) Colorímetro El colorímetro se utiliza para medir el color de la solución y es el componente principal de la solución. El objeto de prueba, como los glóbulos rojos en la sangre, también puede agregar un reactivo a la prueba. Objeto para formar un producto coloreado (un cromóforo), como el uso del método de la ninhidrina para determinar el contenido de aminoácidos. Se requiere una curva estándar para una sustancia. La curva estándar se elabora midiendo un contenido conocido de la sustancia. sustancia mientras se mide la muestra a analizar, en lugar de utilizar la relación de Beer-Lambert.

La fuente de luz suele ser una bombilla de filamento de tungsteno. Después de ser enfocada por una lente convexa, se genera un haz de luz paralelo. La luz paralela pasa a través de la muestra de vidrio o celda pequeña que contiene la solución y luego pasa a través de un filtro de color para llegar al detector del tubo fotoeléctrico. El detector genera un haz de luz que incide sobre el tubo fotoeléctrico. densidad La señal del tubo fotoeléctrico se amplifica y luego se transmite al galvanómetro o lectura digital.

Cómo utilizar el colorímetro:

① Encienda la alimentación.

Para estabilizar el instrumento, deje que la lámpara se precaliente durante al menos 5 minutos antes de usarla; ② Seleccione un filtro con un color complementario al sustrato; ③ Cero (use un control en blanco a cero); ⑤ Analice las muestras y las soluciones estándar; ⑥Debido a las diferentes características de absorción de luz y espesor de pared de diferentes vasos colorimétricos, para mejorar la precisión, se debe utilizar el mismo vaso colorimétrico en la misma prueba y colocarlo en la misma orientación en el tanque colorimétrico; ⑦Limpie el colorímetro antes de cada uno; vaso medidor de muestra; ⑧ Repita con frecuencia las mediciones de la misma solución para probar la repetibilidad del colorímetro. ⑨ Utilice soluciones estándar para dibujar una curva estándar.

Dado que la luz filtrada por la mayoría de los filtros tiene una banda ancha, la colorímetro El colorímetro no se puede utilizar para determinar un determinado compuesto, ni puede distinguir entre dos sustancias con características de absorción muy similares en una mezcla. El coeficiente de variación de la célula fotoeléctrica utilizada en el colorímetro es de aproximadamente 0,5, por lo que no es adecuado para trabajar. eso requiere un alto grado de precisión. Usando este instrumento más simple, debido a la arbitrariedad de la unidad de escala de medición logarítmica en el instrumento, incluso si la sensibilidad/escala en el medidor se ajusta al punto de control cero, el valor obtenido en uno. El instrumento no se puede comparar directamente con otro instrumento. En comparación con los valores medidos en el mismo instrumento, las diferentes configuraciones del mismo instrumento no se pueden comparar directamente.

(2) Espectrofotometría ultravioleta/visible El dispositivo básico del espectrofotómetro UV/visible utiliza una lámpara de tungsteno de alta intensidad como fuente de luz, que se puede ajustar en el rango visible (400~700 nm). La lámpara de deuterio se utiliza para espectrofotometría ultravioleta. medición (200 ~ 400 nm cuando se utiliza una lámpara de deuterio, utilice una copa de cuarzo porque los rayos ultravioleta no pueden atravesar el vidrio.

La razón por la que el espectrofotómetro es mejor que el colorímetro es que utiliza una rejilla de difracción para convertir la luz policromática de la fuente de luz en un haz paralelo monocromático. De hecho, esta luz monocromática produce luz no en una determinada longitud de onda, sino en un ancho de banda estrecho. El ancho de banda es una característica importante de un espectrofotómetro porque determina la longitud de onda utilizada en. mediciones de absorción: el ancho de banda de un espectrofotómetro ordinario es de 5 a 10 nm. El ancho de banda del instrumento utilizado para la investigación es menor que eso. El ancho del espacio de la rejilla afecta el ancho de banda a medida que disminuye el ancho del espacio de la rejilla. Para obtener datos precisos en una longitud de onda específica, utilice en la medida de lo posible el ancho de rendija más pequeño. Sin embargo, reducir el ancho de la rendija también reducirá la luminosidad que llega al monitor, lo que reducirá la relación señal/ruido. La reducción depende de la sensibilidad y estabilidad del sistema de detección/amplificación en presencia de luz discreta.

La trayectoria de la luz de la cubeta utilizada por la mayoría de los espectrofotómetros UV/visible es de 10 nm. Los vasos de plástico desechables son adecuados para. medición de soluciones de agua y etanol en el rango de luz visible. Colorimetría de vidrio La producción de cubetas requiere estándares más estrictos, por lo que las cubetas de vidrio deben usarse en investigaciones precisas, especialmente cuando el valor de absorción de la solución es muy bajo (lt; 0,1). Incluso si las cubetas que contienen la solución de control y la solución de muestra a analizar tienen propiedades ópticas ligeramente diferentes, también provocarán desviaciones en los resultados. El vidrio y el plástico absorberán la luz ultravioleta, por lo que se deben utilizar copas de cuarzo al medir los valores de absorción. con longitudes de onda inferiores a 300 nm.

Antes de la medición, la cubeta asegúrese de que esté limpia, sin rayones, la superficie exterior esté seca, el líquido se llene a la altura adecuada y se coloque en la posición correcta en el Tanque colorimétrico. Las proteínas y los ácidos nucleicos de las muestras biológicas pueden depositarse en la superficie interna del vaso de vidrio/cuarzo, por lo que es necesario utilizar una bolita de algodón humedecida en acetona para limpiar la precipitación de la cubeta o remojarla en 1 mol/. L de ácido nítrico durante la noche para soluciones corrosivas y tóxicas se deben utilizar cubetas con tapa para evitar salpicaduras y daños al instrumento.

Los espectrofotómetros básicos utilizan fotocélulas similares a las que se utilizan en los colorímetros. En muchos casos, se deben utilizar fotocélulas diferentes para. longitudes de onda por encima y por debajo de 550 ~ 600 nm. Esto se debe a que funcionan en luz visible. La sensibilidad dentro de la longitud de onda es diferente, y los instrumentos más interesantes utilizan detectores con mayor sensibilidad y estabilidad que las fotocélulas que están reemplazando gradualmente las lecturas del puntero. propenso a errores visuales y errores de rango de lectura. Algunos instrumentos pueden proporcionar directamente la concentración de la sustancia que se está midiendo.

Tipos de espectrofotómetros UV/visible:

Los espectrofotómetros básicos solo producen uno. haz de luz este instrumento primero Utilice el control en blanco para ajustar a cero.

Luego saque el líquido en blanco, agregue el líquido a probar y mida el valor de absorción del líquido a probar. También hay un espectrofotómetro de doble haz, en el que el haz de luz generado por una fuente de luz monocromática se divide en dos. Haces, y un haz pasa a través del líquido a probar, el otro haz pasa a través del líquido en blanco. El valor de absorción se mide mediante un circuito electrónico comparando la luz emitida a través del líquido a probar y el líquido en blanco. El espectrofotómetro de haz reduce la inestabilidad de la salida de la fuente de luz o los cambios en la sensibilidad del sistema de detección. El error de medición causado por esto se debe a que el líquido de prueba y el líquido de control se miden al mismo tiempo. Instrumento de medición de haz utilizado para registrar el cambio del valor de absorción a lo largo del tiempo en una banda de ondas conocida (como el uso para análisis enzimático).

Análisis cuantitativo del espectrofotómetro:

Si la absorbancia. de una sustancia a una determinada longitud de onda (generalmente el valor máximo de absorción de la sustancia, la sensibilidad es más alta en este momento), la concentración de la solución pura de esta sustancia se puede calcular mediante la relación de Beer-Lambert. La absorción molar. El coeficiente se refiere al valor de absorción de la sustancia a una concentración de 1 mol/L y el espesor de la cubeta es de 1 cm. Este valor se puede encontrar en la tabla de datos del espectro, o puede utilizar métodos experimentales para dibujar una curva estándar midiendo. los valores de absorción de una serie de sustancias con concentraciones conocidas, de esta manera, dentro del rango de concentración requerido, se puede determinar la relación entre el valor de absorción y la concentración, y la pendiente de la recta. la línea es el coeficiente de absorción molar.

La absorbancia específica se refiere al valor de absorbancia medido cuando la concentración de la solución en masa de la sustancia es de 10 g/l y el espesor de la cubeta es de 1 cm. Este valor es útil para el. determinación de sustancias con masa molecular desconocida, como proteínas y ácidos nucleicos. En este caso, el contenido de la sustancia en la solución se expresa por su masa en lugar de por su concentración molar cuando se utiliza la fórmula Log10(Io/I)=εl. [C], la absorbancia específica debe dividirse por 10 para obtener un valor de concentración en g/L.

Este método simple no se puede utilizar para determinar muestras mezcladas. En este caso, es posible realizar la medición. La absorbancia en varias longitudes de onda se utiliza para estimar el contenido de cada componente. Si este método se puede utilizar para estimar el contenido de proteínas en presencia de ácidos nucleicos.

Cómo utilizar un espectrofotómetro:

(1) Encienda la alimentación; (2) Precaliente durante 15 minutos antes de usar; (3) Seleccione la longitud de onda; (4) Seleccione el detector (5) Si es posible, seleccione el ancho de ranura correcto; Inserte un control en blanco apropiado; (7) Ajuste la transmitancia a 0; (8) Ajuste el valor de absorbancia a cero (9) Analice la muestra (10) Después de medir cada 10 muestras, use un control en blanco para verificar la escala cero; ; (11) Repetibilidad del instrumento de detección.