¿Qué es el cultivo celular y cuáles son sus elementos básicos?

1. Procedimientos operativos:

1. Antes del experimento, esterilice la sala estéril y la mesa de operaciones estéril con rayos ultravioleta durante 30-60 minutos y límpielos con un 70%. mesa de operaciones estéril con alcohol, encienda el ventilador de la mesa de operaciones estéril durante 10 minutos y luego se podrá iniciar la operación experimental. Procese sólo una celda a la vez para evitar la contaminación cruzada de las células. Después del experimento, retire los elementos experimentales de la mesa. Si necesita continuar con el siguiente experimento, limpie la mesa de operaciones estéril con alcohol al 70% y luego deje funcionar el ventilador de la mesa de operaciones estéril durante 10 minutos antes de continuar con el siguiente experimento.

2. El área de trabajo para operaciones asépticas debe mantenerse limpia y espaciosa. Los elementos necesarios, como tubos de ensayo, pipetas o pajitas, se pueden colocar temporalmente. Otros elementos experimentales deben retirarse inmediatamente después de su uso para facilitar la circulación del gas. Los elementos experimentales deben limpiarse con alcohol al 70% antes de ingresar a la mesa de operaciones esterilizada. Las operaciones experimentales deben realizarse en el área estéril en el centro de la consola y no en el área no estéril en el borde.

3. Saque con cuidado los suministros experimentales estériles para evitar la contaminación. No toque las cabezas de las pipetas y las puntas ni la boca del recipiente, y no realice experimentos directamente encima de recipientes abiertos. Después de abrir el recipiente, sostenga la tapa de la botella con las manos, sostenga el cuerpo de la botella e inclínelo aproximadamente 45°. Trate de no colocar la tapa de la botella sobre la mesa con la tapa hacia arriba.

4. El personal debe prestar atención a su propia seguridad y debe usar batas y guantes de laboratorio antes de realizar experimentos. Se debe prestar especial atención a las líneas celulares de origen humano o infección por virus, y se debe seleccionar un nivel apropiado de mesa de operaciones estéril (al menos dos niveles). Durante el funcionamiento, evite generar aerosoles, tenga cuidado con reactivos tóxicos como DMSO y TPA y evite herir a personas con objetos punzantes.

5. Compruebe periódicamente los siguientes elementos: presión de CO2 en el cilindro de CO2; concentración de CO2 y temperatura en la incubadora de CO2, si la bandeja de agua está contaminada y si la presión del flujo de aire en la mesa de operaciones estéril es normal; y reemplazó periódicamente la lámpara UV, la membrana de filtro HEPA y la prefiltración (300 horas/prefiltración, 3000 horas/HEPA).

2. Preparación de medio de cultivo celular en polvo (tomando 1 litro como ejemplo):

El medio de cultivo celular generalmente necesita agregar un 10% de suero, por lo que el volumen de preparación del medio de cultivo en polvo es 900 ml el pH es 7,2-7,4. Agregue bicarbonato de sodio por separado. Si se agrega polvo de bicarbonato de sodio directamente al medio de cultivo líquido, se producirán errores de pH o hiperalcalinidad local. Por lo tanto, el medio de cultivo en polvo y el polvo de NaHCO3 deben disolverse por separado antes de mezclarlos y luego usar CO2 gaseoso para ajustar el pH, en lugar de ácido fuerte (HCl) o álcali fuerte (NaOH), porque los iones de cloruro pueden afectar el crecimiento celular y la El valor de pH del medio de cultivo está entre Los cambios ocurren fácilmente durante el almacenamiento.

Reactivos y equipos

1. Agua purificada (agua mili-Q o agua destilada secundaria o terciaria, la calidad del agua es muy importante)

2. ( 1640, DMEM, etc.)

3. Bicarbonato de sodio (Sigma S-4019)

4. Agitador electromagnético

5. p>

Membrana filtrante estéril de 6.0.22 micrones

7. Medidor de pH

8.Válvula de vacío

9.

Pasos de preparación

1. Disolver el medio de cultivo en polvo en 700 ml de agua milli-Q y agitar para disolver.

2. Pese una cantidad adecuada de NaHCO3 en polvo (diferente según el tipo de medio de cultivo) y disuélvalo en 200 ml de agua Milli-Q, revuelva para disolver y luego agregue CO2 gaseoso hasta que se sature, aproximadamente 3. -5 minutos.

3. Añadir la solución de NaHCO3 disuelta que contiene CO2 saturado al medio de cultivo líquido disuelto y mezclar. El valor del pH de la solución mezclada debe ser de 7,2 a 7,4, a menos que el valor del pH se desvíe demasiado, no es necesario ajustarlo con ácido y álcali. Si la alcalinidad es demasiado fuerte, se puede introducir gas CO2 para ajustar el valor del pH. Cuando el vacío medio pasa a través de la membrana del filtro, el pH aumentará entre 0,1 y 0,2.

4. Utilice una membrana filtrante estéril de 0,1 o 0,2 mm para filtrar y esterilizar, y al mismo tiempo envasarla en recipientes esterilizados, indicar el tipo, fecha y número de botella del medio de cultivo y almacenar. a 4°C (también se puede cultivar. Añadir suero a la base y filtrar).

5. El medio de cultivo preparado debe analizarse para detectar crecimiento y contaminación.

Cosas a tener en cuenta

1. El medio de cultivo líquido debe almacenarse en un refrigerador a 4 °C en la oscuridad y calentarse en un tanque de agua a 37 °C antes del experimento.

2. El periodo de almacenamiento del medio de cultivo líquido (que contiene suero) es de seis meses, durante el cual se puede descomponer la glutamina. Si las células crecen mal, puedes añadir una cantidad adecuada de glutamina.