¿Cuál es el principio del método Bradford para determinar el contenido de proteínas? Cómo superar la influencia de factores adversos en la determinación.

Para determinar el contenido de proteínas se utilizó el método de Bradford, es decir, el método del azul brillante de Coomassie. El principio es que Coomassie Brilliant Blue aparece de color marrón rojizo en el estado ionizado y su máxima absorción de luz es de 488 nm. Cuando se combina con proteínas, se vuelve azul y las proteínas absorben la luz máxima a una longitud de onda de 595 nm cuando se combinan con pigmentos. Su valor de absorbancia es proporcional al contenido de proteína y puede usarse para la determinación cuantitativa de proteínas.

La proteína y Coomassie Brilliant Blue alcanzan el equilibrio en aproximadamente 2 minutos y la reacción es muy rápida. El adhesivo permanece estable a temperatura ambiente durante 1 hora. Los reactivos preparados mediante este método son simples, fáciles de operar y tienen una alta sensibilidad de reacción. La sensibilidad es 4 veces mayor que la del método Lowry y puede determinar el contenido de proteínas a nivel de microgramos. Las principales desventajas son la estructura de la proteína particular y los agentes de interferencia en el tampón.

Información ampliada:

Proceso de determinación del contenido de proteínas mediante el método Coomassie Brilliant Blue:

1 Preparación del tinte concentrado Bradford: añadir 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250. Disuelva en 50 ml de etanol 95, agregue 100 ml de ácido fosfórico al 85%, luego agregue agua destilada a 200 ml. La solución de tinte debe mantenerse estable a 4°C durante al menos 6 meses.

2. Preparación de muestras de proteínas de curva estándar: Intente utilizar proteínas con propiedades similares a las de las muestras a analizar como estándares. Por ejemplo, al medir anticuerpos, se pueden utilizar anticuerpos purificados como estándares. Si se desconoce la muestra a analizar, también se pueden utilizar anticuerpos como proteínas estándar. La curva estándar generalmente se dibuja entre 20ug y 150ug/100ul.

3. Disuelva la muestra a analizar en la solución tampón. La solución tampón debe ser la misma que la solución tampón utilizada para hacer la curva estándar (es mejor utilizar PBS).

4. Diluir la solución concentrada aglutinante de tinte con agua destilada en una proporción de 1:4. Si se produce precipitación, filtrar.

5. Añadir 5ml de solución fijadora de tinte diluida a cada muestra y dejar actuar de 5 a 30 minutos. Una vez que el tinte se combina con la proteína, cambia de rojo a azul y su absorbancia se mide a una longitud de onda de 595 nm. Tenga en cuenta que la reacción del color no debe exceder los 30 minutos.

6. Calcular la concentración de la muestra a analizar en base a la curva estándar.

Nota: Este método es relativamente preciso para la cuantificación de la mayoría de proteínas, pero no es adecuado para la cuantificación de péptidos básicos de moléculas pequeñas. Como la ribonucleasa o la lisozima. La concentración de detergente superior a 0,2 afectará los resultados de la medición. Como TritonX-100, SDS, NP-40, etc.

Enciclopedia Baidu-Método del azul brillante de Coomassie