Traducción del medidor de ácido úrico
Biosensor amperométrico de fenol
Membrana compuesta de silicato sol-gel/Nafion
Min'e Jin, Li Yuanyong?
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Fenol de tipo actual basado en membrana compuesta de silicato sol-gel/ácido perfluorosulfónico
Biosensor
Jin Min'e, Li Yuanyong
Departamento de Química, Universidad de Yonsei, 120-749, Seúl, Corea del Sur
Fecha de recepción: 9 de agosto de 2002; fecha de reanudación: 18.11.2002; fecha de publicación: 28.11.2002
Resumen
Se han utilizado biosensores amperométricos basados en tirosinasa inmovilizada sobre membranas compuestas de silicato/ácido perfluorosulfónico para la determinación de diversos compuestos fenólicos. El polímero de ácido perfluorosulfónico en la membrana compuesta no solo supera la fragilidad de las membranas de silicato sol-gel puro sino que también mejora la estabilidad a largo plazo del biosensor. La tirosinasa se inmovilizó sobre el electrodo de carbón vítreo a través de una membrana compuesta de silicato/ácido perfluorosulfónico. El contenido de compuestos fenólicos depende de la reducción del contenido de quinonas libres con actividad biocatalítica. El experimento se realizó a un potencial de 200 mV, utilizando Ag/AgCl (3MNaCl) como electrodo de referencia. Los parámetros del proceso y diversas variables experimentales del electrodo enzimático preparado mediante este método, como el valor de pH y el potencial de trabajo, se han seleccionado como los valores mejor optimizados y adecuados para el funcionamiento del electrodo enzimático. En 15 segundos, el valor actual del biosensor puede alcanzar el 95% del valor actual en estado estable. La sensibilidad de este sensor al catecol y al fenol es de 200 mA∕M y 46mA∕M respectivamente. Cuando la relación señal-ruido es 3, el límite de detección del catecol es 0,35 mm. Después de almacenarse en una solución tampón de fosfato con un valor de pH de 7 y una concentración de 50 mM durante dos semanas, el electrodo enzimático aún conserva el valor. actividad inicial del 74%.
Copyright 2002 Elsevier Technology Co., Ltd.
Palabras clave: tecnología sol-gel; membrana compuesta de silicato/ácido perfluorosulfónico; tirosinasa; compuestos fenólicos; biosensor amperométrico
1 Introducción
p>Por su toxicidad. y persistencia en el medio ambiente, es necesario determinar el contenido de compuestos fenólicos. Dado que los compuestos fenólicos pueden tener efectos adversos en la salud humana, debemos realizar análisis cualitativos y cuantitativos rigurosos de estos compuestos. La concentración de compuestos fenólicos en cuerpos de agua naturales o suelos puede variar hasta cierto punto, pero en general actualmente se encuentran en el nivel de ppb. Hay muchos métodos disponibles para la determinación de compuestos fenólicos, incluida la cromatografía de gases y la espectrofotometría. Sin embargo, estos métodos requieren un pretratamiento complejo de la muestra y tienen condiciones experimentales incontrolables. Para resolver este problema, hemos hecho muchos esfuerzos para encontrar un método simple y eficaz para la determinación de compuestos fenólicos. Los sensores de fenol de tipo corriente basados en tirosinasa han demostrado ser prometedores para lograr este objetivo, y también se han utilizado varios modelos, como pasta de carbón, grafito epoxi y otros materiales compuestos, para dopar la superficie del electrodo de tirosinasa.
En los últimos años, la química sol-gel ha proporcionado una nueva plataforma electroquímica para los campos de los sensores químicos y biosensores. Debido a su proceso inherente de baja temperatura, la tecnología sol-gel proporciona un método factible para la inmovilización de organismos sensibles al calor (enzimas, proteínas y anticuerpos). Este modelo de silicato sol-gel tiene las características de estabilidad química, rigidez física, biocompatibilidad, sintonizabilidad de porosidad, alta estabilidad fototérmica y transmitancia de luz. Precisamente por estas extraordinarias propiedades se han llevado a cabo investigaciones más profundas en el ámbito de los biosensores ópticos y electroquímicos. Por ejemplo, para los sensores de fenol, Tan y sus colegas publicaron un informe sobre un biosensor amperométrico de fenol inmovilizado por sol-gel de sílice. Además, el sol-gel de Al2O3 también se ha considerado como un modelo adecuado para mejorar la estabilidad de la inmovilización de tirosinasa. Sin embargo, a pesar de las muchas ventajas de los modelos sol-gel, el agrietamiento de los modelos sol-gel con el tiempo sigue siendo un problema potencial.
Para evitar grietas, algunos polímeros, como el óxido de polietileno, el polietilenglicol, el polihidroxi, el polímero natural quitosano y la polivinilpiridina y el alcohol polivinílico injertados, se combinan con modelos de silicato sol-gel para formar materiales híbridos orgánicos-inorgánicos, cada uno de ellos orgánico-inorgánico. El material híbrido tiene sus propias propiedades únicas. Por ejemplo, los materiales híbridos orgánicos-inorgánicos a base de quitosano son biodegradables y no tóxicos porque el quitosano es un producto polimérico natural. Además, el quitosano contiene grupos amino y, por tanto, proporciona un entorno hidrófilo compatible con las biomacromoléculas. Los materiales híbridos orgánicos-inorgánicos a base de polivinilpiridina y alcohol polivinílico injertados con polímeros * * * pueden prevenir el agrietamiento del vidrio estacional durante el proceso sol-gel al tiempo que eliminan la hinchazón de los hidrogeles poliméricos * * *.
Este artículo informa por primera vez sobre un biosensor amperométrico de tirosinasa inmovilizado en una membrana compuesta de silicato sol-gel/ácido perfluorosulfónico (ionómero sulfonato). Este tipo de material de membrana compuesto puede superar la fragilidad del modelo de silicato sol-gel puro y retrasar la contracción del silicato. Otra ventaja de la membrana compuesta es que el ácido perfluorosulfónico es biocompatible con la tirosinasa, lo que mejora enormemente la estabilidad a largo plazo del sensor de fenol. Además, durante la preparación de la membrana compuesta, la selectividad del biosensor se puede determinar seleccionando apropiadamente la proporción de silicato a ácido perfluorosulfónico. Esto se debe a que la membrana de ácido perfluorosulfónico contiene grupos de ácido sulfónico cargados negativamente, que pueden evitar que las sustancias cargadas negativamente migren y se depositen en la superficie del electrodo. A continuación, analizaremos más a fondo las condiciones optimizadas de la membrana compuesta de silicato sol-gel/ácido perfluorosulfónico y los parámetros experimentales que afectan la respuesta electroquímica del biosensor, como el potencial operativo y el valor de pH. Además, para el rendimiento del sensor, discutiremos y estudiaremos el tiempo de respuesta, la sensibilidad, el límite de detección y la estabilidad a largo plazo.
2 Experimentos
2.1 Reactivos
El tetrametoxisilicato (TMOS, 99) se adquirió de AcrosChemical Company (Bélgica). La tirosinasa (extraída de hongos, EC 1.14.18.1.4400 unidades/mg) se adquirió de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). El catecol, el fenol, el cresol, el 4-clorofenol y el acetato de 4-aminofenol se adquirieron de Aldrich (Milwaukee, WI, EE. UU.). Cada vez, la solución de trabajo se diluyó hasta la concentración deseada con solución tampón fosfato 0,05 M, pH 7,0. El ácido perfluorosulfónico (una resina de intercambio iónico de ácido sulfónico preparada disolviendo 5 (p/v) del mismo en una solución mixta de 90 alcohol graso/10 agua (relación en volumen)) se adquirió de Aldrich. Toda el agua de dilución en este experimento se purificó mediante un sistema de purificación de agua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.). Todos los reactivos químicos utilizados en este experimento cumplen con los requisitos de reactivos. No se requirió purificación adicional a menos que se indique lo contrario.
2.2 Instrumento
Todos los experimentos de voltamperometría cíclica y amperométrica de este artículo se realizaron, por ejemplo, en una estación de trabajo electroquímica G 273 (Oak Ridge, Tennessee, EE. UU.). Todos los experimentos se realizaron utilizando un sistema convencional de tres electrodos. Entre ellos, el electrodo de carbón vítreo se utiliza como electrodo de trabajo (1,75000000000002 px2, la superficie está cubierta con una capa de enzima), el alambre de platino se utiliza como contraelectrodo y Ag/AgCl (3MNaCl) se utiliza como electrodo de referencia. (Todos los valores potenciales mencionados en el artículo son valores relativos). Un vaso de precipitados de 10 ml y un agitador magnético.
2.3 Preparación del biosensor de fenol
Mezclar 1,0ml de TMOS, 200μl de agua desionizada y 10μl de HCl con una concentración de 0,1M en un vaso de precipitados pequeño y dispersar vigorosamente a temperatura ambiente durante 10 minutos hasta Se dispersó uniformemente y luego se dejó reposar la solución a temperatura ambiente durante 12 horas para obtener la solución madre sol-gel. La solución madre se mezcló con la solución de ácido perfluorosulfónico (suspensión sol-gel/ácido perfluorosulfónico = 1/2 (relación en volumen)), formando así una solución compuesta de silicato sol-gel/ácido perfluorosulfónico.
Al mismo tiempo, se diluye la tirosinasa a una concentración de 15 mg/ml con un tampón de fosfato con un pH de 7,0 y una concentración de 0,05 M. Luego, se añaden 30 l de solución compuesta de silicato/ácido perfluorosulfónico y 30 l de arginasa. mezclado para obtener una suspensión. Tome 1,0 μl de esta solución y cúbrala sobre la superficie del electrodo de carbón vítreo. Antes de cada experimento, el electrodo de carbón vítreo debe pulirse con α-alúmina de 0,05 μm y luego limpiarse a fondo con agua destilada. La suspensión debe secarse a temperatura ambiente durante 2 minutos para formar una película. Finalmente, antes del primer uso del electrodo enzimático, es necesario remojarlo en una solución tampón de fosfato con un pH de 7,0 y una concentración de 0,05 M a 4 °C durante la noche para eliminar la tirosinasa libre en la superficie del electrodo y mejorar la Polimerización sol-gel. Cuando el electrodo no esté en uso, debe almacenarse en un tampón de fosfato con un valor de pH de 7,0 y una concentración de 0,05 M en un refrigerador a 4°C.
2.4 Condiciones experimentales
Al realizar la detección amperométrica en el líquido a probar, el líquido a probar utiliza 10 ml de solución tampón fosfato con un valor de pH de 7,0 y una concentración de 0,05 M. como medio, y está en un estado constante en un ambiente agitado. Los agitadores y agitadores magnéticos brindan capacidades de migración de electrones para la detección amperométrica. En comparación con el electrodo de referencia Ag/AgCl (NaCl 3 M), el electrodo de trabajo se mantuvo a un potencial constante de -0,2 V y la corriente de fondo descendió a un valor estable antes de agregar una alícuota de la solución estándar del compuesto fenólico al electrodo electroquímico. solución de prueba.
3 Resultados y Discusión
3.1 Efecto del silicato sol-gel/ácido perfluorosulfónico
Influencia del patrón
Es bien sabido que Las condiciones de preparación de sol-gel tienen una gran influencia en la respuesta electroquímica de los biosensores sol-gel. En particular, la proporción de alcohol y agua en la solución madre de sol-gel afecta fuertemente la penetración del biosensor de sol-gel debido al efecto de hidrólisis catalizada por ácido. Los ejemplos incluyen electrodos compuestos de carbono inmovilizados con glucosa oxidasa y electrodos de pasta de carbono inmovilizados con peroxidasa de rábano picante y ácido úrico. Sobre la base de estudios previos, preparamos geles de silicato con una proporción relativamente alta de TMOS y agua de 5, formando un modelo sol-gel relativamente denso con tamaños más pequeños, lo que resulta en una mayor carga de enzimas y respuestas biológicas más grandes.
Se ha informado que es necesaria una hidrofobicidad moderada para mantener una actividad tirosinasa óptima. El ácido perfluorosulfónico tiene una cadena principal de fluorocarbono hidrófobo y sitios de intercambio catiónico hidrófilos, por lo que es moderadamente hidrófobo. Por lo tanto, el ácido perfluorosulfónico se mezcla con silicato sol-gel para formar un material híbrido orgánico-inorgánico. Midiendo los datos de respuesta actual de diferentes proporciones de soluciones de ácido perfluorosulfónico/silicato sol-gel (relación de volumen) o películas de silicato sol-gel puro y luego realizando un ajuste de calibración, se puede obtener la curva estándar. La Figura 1 muestra una curva de calibración de catecol típica y sus características experimentales se resumen en la Tabla 1. Según esta observación, la respuesta actual del biosensor es máxima cuando la relación entre los dos anteriores es 2. Los resultados mostraron que cuando la proporción de ácido perfluorosulfónico a solución compuesta de silicato sol-gel era inferior a 2, la estabilidad y sensibilidad de la tirosinasa aumentaban con el aumento del contenido de ácido perfluorosulfónico. Sin embargo, aumentar aún más la proporción de ácido perfluorosulfónico en la membrana compuesta aumentará la hidrofobicidad de la membrana compuesta, lo que conducirá a la desnaturalización de la tirosinasa, reduciendo así su sensibilidad. Además, dado que la estabilidad del PFOS está mediada por el etanol, el aumento de la proporción de PFOS en la membrana compuesta puede dar lugar a una mayor inactivación de la tirosinasa inducida por el etanol. Los biosensores basados en películas puras de silicato sol-gel son muy inestables, propensos a romperse, exhiben un rango dinámico a corto plazo y una baja sensibilidad.
Cuando la concentración de catecol alcanza 9,9 μM, comienza la respuesta (el tiempo de respuesta es inferior a 22 s). Cuando se mezclan ácido perfluorosulfónico y sol-gel de silicato en cualquier proporción, la respuesta actual cambia con el catecol. La concentración aumenta al aumentar la concentración de fenol. El tiempo de respuesta está relacionado con la proporción de membrana compuesta de ácido perfluorosulfónico/sol-gel silicato, pero su tiempo de respuesta es mucho más corto que el del electrodo de tirosinasa basado en membrana pura de silicato sol-gel (50 s). Dado que el espesor de la película de silicato sol-gel puro y la membrana compuesta de silicato/ácido perfluorosulfónico es similar (menos de 10 μm), el tiempo de respuesta rápido correspondiente depende principalmente del aumento en el tamaño de los poros de la membrana compuesta de silicato sol-gel, lo que también resulta en la rápida difusión del sustrato y del producto dentro y fuera de la película.
Este comportamiento también ocurre en electrodos de tirosinasa inmovilizados por películas de polímero de silicato/polietileno sol-gel. En experimentos de electroluminiscencia con Ru(bpy)32, la película compuesta de silicato sol-gel/ácido perfluorosulfónico produce una estructura más abierta en comparación con la película de silicato puro, mejorando así su señal de luminiscencia. Por lo tanto, en experimentos posteriores, se eligió que la proporción óptima de ácido perfluorosulfónico a sol-gel de silicato fuera 2. Además, también se está estudiando la relación entre la microestructura de las membranas compuestas de silicato/ácido perfluorosulfónico dopado con enzimas y las propiedades del biosensor.