¿Cuáles son las principales técnicas experimentales en el estudio de la regulación de la expresión génica?
Las principales técnicas experimentales para la regulación de la expresión génica incluyen: ChIP, RIP, RNA pull-down, EMSA, Luciferase
Experimento ChIP
Al interactuar con fragmentos de cromatina ***Las técnicas de precipitación y PCR detectan fragmentos de ADN unidos a proteínas específicas in vivo. Las células vivas en una etapa de crecimiento adecuada se entrecruzan con formaldehído y luego se lisan. Los cromosomas se separan y fragmentan en fragmentos de un cierto tamaño de 200 pb a 1000 pb. Luego se utilizan anticuerpos específicos para inmunoprecipitar el complejo entrecruzado entre la proteína objetivo. y se enriquecen las proteínas diana y los fragmentos de ADN. Utilizando condiciones de pH bajo para revertir el entrecruzamiento, el enlace de Schiff entre el ADN y la proteína se hidroliza, liberando fragmentos de ADN. Mediante la purificación y detección de fragmentos diana se obtiene información secuencial sobre la interacción entre el ADN y las proteínas.
2. Experimento RIP
La tecnología RIP (RNA BindingProtein Immunoprecipitation, inmunoprecipitación de proteínas de unión a ARN) es una tecnología para estudiar la unión de ARN y proteínas en las células. Los anticuerpos contra la proteína diana se usan para precipitar el complejo ARN-proteína correspondiente y luego el ARN unido al complejo se puede analizar después de la separación y purificación, es decir, se usan anticuerpos o marcadores de epítopos para capturar sustancias endógenas en el núcleo o citoplasma; La proteína de unión a ARN específica previene la unión de ARN no específica. La inmunoprecipitación separa la proteína de unión a ARN y su ARN unido. La secuencia de ARN unida se pasa a través de microarrays (RIP-Chip), RT-PCR cuantitativa o secuenciación de alto rendimiento. Método (RIP-Seq) para identificar. Es una herramienta poderosa para comprender el proceso dinámico de las redes reguladoras postranscripcionales y puede ayudarnos a descubrir los objetivos reguladores de los miARN.
3. Experimento de extracción de ARN
Utilice el método de transcripción in vitro para marcar la sonda de ARN de biotina y luego incúbela con el extracto de proteína citoplasmática para formar un complejo de ARN-proteína. . El complejo se une a perlas magnéticas marcadas con estreptavidina y, por lo tanto, se separa de otros componentes en la solución de incubación. Una vez eluido el complejo, se realizan experimentos de transferencia Western para detectar si proteínas de unión a ARN específicas interactúan con el ARN.
4. Experimento EMSA
Ensayo de cambio de movilidad electroforética o migración de gel (EMSA-ensayo de cambio de movilidad electroforética) es un método para estudiar la interacción entre las proteínas de unión al ADN y sus proteínas relacionadas. Secuencias de unión. La tecnología se puede utilizar para estudiar la interacción entre las proteínas de unión al ADN y sus secuencias de unión al ADN relacionadas, así como el análisis cualitativo y cuantitativo del ADN. Las sondas marcadas con biotina pueden ser bicatenarias o monocatenarias, según la proteína de unión que se estudie.
5. Experimento de luciferasa
Luciferasa es el nombre colectivo de las enzimas que pueden producir bioluminiscencia en la naturaleza. Diferentes organismos que pueden controlar la luminiscencia utilizan diferentes luciferasas para catalizar diferentes reacciones luminiscentes.
La reacción de generación de fluorescencia se suele dividir en los siguientes dos pasos:
Luciferina + ATP → adenilato luciferilado (luciferiladenilato) + PPi
Adenilato luciferilado + O2 → Oxyluciferin + AMP + Light
El gen de la luciferasa se puede sintetizar e insertar en organismos o transfectar en células para convertir diferentes tipos de luciferasa mediante el marcaje (es decir, expresión) en células (células madre de la médula ósea, células T, etc.), se puede utilizar una cámara CCD de alta sensibilidad para la observación in vivo de animales sin dañarlos. Agregar el sustrato de luciferina correcto a la luciferasa puede emitir fluorescencia, y los fotones emitidos pueden detectarse mediante componentes sensibles a la luz, como detectores fluorescentes o microscopios ópticos mejorados. Esto hace posible observar una variedad de procesos de actividad vital, incluida la infección.
El análisis de luciferasa se puede utilizar en la investigación de promotores para analizar elementos que actúan en cis y factores que actúan en trans, detección de fármacos, detección de ARNip y miARN, detección de genes informadores de localización de proteínas y vías secretoras, y monitoreo en tiempo real de células vivas Investigación dinámica, análisis de vías de transducción de señales, investigación sobre células difíciles de transfectar (incluidas células madre y células primarias) e investigación de empalme de ARN.
La prueba del gen reportero de luciferasa dual es una tecnología avanzada de prueba del gen reportero *** que combina la luciferasa celenterada de luciérnaga y marina. Cuando se cuantifica la expresión genética utilizando luciferasa de luciérnaga, a menudo se utiliza un segundo gen informador para reducir la variabilidad experimental. El sistema de prueba de gen indicador de luciferasa dual, combinado con el sistema de vector pRL, expresa el segundo gen indicador de luciferasa celenterada marina y realiza pruebas de gen indicador de luciferasa dual en un solo tubo, que es rápido, sensible y simple. Tiene una amplia gama de aplicaciones y puede analizar simultáneamente múltiples elementos regulatorios, analizar múltiples vías de transducción de señales, detectar más de un objetivo a la vez (incluidos efectos fuera del objetivo y analizar la interacción entre dos o más vías).