Descripción detallada del sistema indicador de luciferasa dual
Gen informador: un gen que codifica una proteína o enzima detectable, es decir, un gen cuyo producto de expresión es fácil de identificar.
Por lo general, la secuencia codificante del gen informador se fusiona con la secuencia reguladora de la expresión génica para formar un gen quimérico, o se fusiona con otros genes diana para utilizar su producto de expresión para calibrar la regulación de la expresión del gen diana. .
Los genes reporteros se utilizan ampliamente en el estudio de la regulación de la expresión génica. Los ejemplos incluyen la proteína verde fluorescente (GFP) y la luciferasa.
La luciferasa es una enzima que puede catalizar la oxidación y luminiscencia de diferentes sustratos. No existe luciferasa endógena en las células de mamíferos.
Ventajas de los genes reporteros de la luciferasa
La proteína no requiere procesamiento postraduccional, por lo que una vez traducida, se genera inmediatamente actividad reportera.
De entre todas las reacciones de quimioluminiscencia, su producto luminoso tiene la mayor eficiencia cuántica, por lo que es muy sensible. Además, no se detecta ninguna luminiscencia de fondo en las células huésped ni en los reactivos de detección.
Detección rápida, tardando sólo unos segundos por muestra.
2. Principio experimental
Basado en la reacción quimioluminiscente entre la luciferasa y el sustrato, el elemento regulador de la transcripción genética de interés se clona en la fase anterior del gen de la luciferasa de luciérnaga. Construcción del indicador de luciferasa. plásmido. Luego las células se transfectan, se lisan después de una estimulación o tratamiento apropiado y se mide la actividad de la luciferasa. Los efectos de diferentes estímulos antes y después de la estimulación sobre los elementos reguladores de interés se juzgan mediante la actividad de la luciferasa.
Al mismo tiempo, para reducir el impacto de los factores de cambio internos (como diferencias en el número y la viabilidad de las células cultivadas, la transfección celular y la eficiencia de la lisis, etc.), utilice Rinilla luciferasa (phRL-TK ) Los plásmidos se utilizan como plásmidos de control y plásmidos de genes indicadores para transfectar células * * para proporcionar un control interno de la actividad transcripcional de modo que los resultados de las pruebas no se vean interferidos por cambios en las condiciones experimentales. Durante el proceso de medición, cuando se agrega el reactivo de detección de luciferasa II (LARII), se genera una señal de fluorescencia de luciérnaga, midiendo así primero el gen indicador de luciferasa de luciérnaga. Después de cuantificar la intensidad de la fluorescencia de las luciérnagas, agregue Stop; Reactivo, apague la reacción anterior, inicie la reacción de luciferasa de Renilla y realice la segunda medición al mismo tiempo.
Tres. Procedimientos operativos y valoración de resultados
A. Preparación de reactivos relevantes antes de realizar la prueba
1. Preparación de tampón de lisis PLB 1X: agregue 4x volúmenes de agua o PBS a 1x volumen de tampón de lisis PLB 5X. (Equilibre el tampón 1X a temperatura ambiente antes de su uso; el equilibrio tarda entre 2 y 3 minutos).
2.? Preparación del reactivo de detección de luciferasa ⅱ (LAR ⅱ): agregue el tampón de detección de luciferasa ⅱ al sustrato de detección de luciferasa, mezcle bien, haga alícuotas y guárdelo en la oscuridad a -20 °C. (Después de la preparación, coloque alícuotas en tubos de ensayo pequeños para evitar la congelación y descongelación repetidas). Antes de usar, retire el LAR II preparado de -20°C y equilibre a temperatura ambiente (tarda entre 20 y 30 minutos).
3.? ¿Detener ampGlo? Preparación de reactivos: Preparación lista para usar, primera parada; Coloque el tampón en una incubadora a 37 grados para equilibrarlo a temperatura ambiente (15-30 min), luego detenga 50x; Añadir 49 veces el volumen de Stop al sustrato; Almacenamiento en búfer.
B.Preparación de la muestra
1.? Aspire con cuidado el medio de crecimiento del pocillo de las células que se van a ensayar. Enjuague las células 2-3 veces con 1XPBS. Tenga cuidado durante este proceso e intente utilizar PBS para absorber el líquido de lavado (para evitar que las células se caigan).
2.? Agregue 100-150 l de tampón de lisis 1x PLB a cada pocillo de la placa de 24 pocillos para cubrir las células, luego agite la placa de 24 pocillos en un agitador durante 20-30 minutos para garantizar que el tampón de lisis lisa completamente las células.
C. Ensayo de luciferasa dual (Promega GLOMAX) (Nota: No toque la pantalla de operación mientras el sistema está funcionando)
1.? Restablecer sistema: ¿Herramienta? Restablecer configuración
2.? Configuración del programa de ensayo de luciferasa dual;
¿Protocolo? ¿Ejecutando el protocolo Promega? DLR-O-INJ OK
3.? Agregue 50 μl de LAR II a un tubo EP de 1,5 ml (tubo EP especial importado), agregue 10 μl de solución de lisis celular al tubo EP de 1,5 ml que contiene LAR II, sople 2 o 3 veces para mezclar (trate de no hacer burbujas) y coloque En el detector, haga clic en "Medir" para comenzar a leer (intensidad de la reacción de luciferasa de luciérnaga). (Antes de usar, LAR II debe mezclarse uniformemente y equilibrarse a temperatura ambiente).
4.? Después de la medición, saque el tubo EP y agregue 50 μl de STOP; Reactivo, sople 2-3 veces para mezclar (trate de no hacer burbujas), póngalo nuevamente en el detector, haga clic en "Medir" para comenzar a leer (intensidad de la reacción de luciferasa de la referencia interna Renilla). (El reactivo Stop amp
Glo? está disponible actualmente y no se puede guardar)
5. Registre las lecturas: cada muestra tendrá tres valores: rlu 1-intensidad de la reacción de luciferasa de luciérnaga, rl U2. -referencia interna Intensidad de la reacción de luciferasa de Renilla, relación-RLU1/RLU2. Generalmente, la proporción se puede registrar, pero RLU1 y RLU2 son valores de intensidad de fluorescencia reales, que pueden reflejar la eficiencia de transfección de las células. La proporción del plásmido indicador con respecto a la referencia interna también se puede ajustar en función de la intensidad de fluorescencia real.
6. Después de la medición, saque el último tubo EP detectado y apague el instrumento.
7. Procesamiento y análisis de resultados experimentales: la prueba T de varianza igual de dos muestras se utiliza para el procesamiento. P <0,05 es una diferencia significativa y P <0,01 es una diferencia extremadamente significativa.
IV.Notas
1. Debido a que la temperatura afecta la reacción enzimática, la muestra y los reactivos deben alcanzar la temperatura ambiente antes de la medición.
2. La solución de trabajo para la detección de luciferasa de Renilla debe usarse inmediatamente después de la preparación y no debe almacenarse durante mucho tiempo después de la preparación.
3. El reactivo de ensayo de luciferasa II (LAR II) no se puede congelar y descongelar repetidamente, por lo que se puede utilizar el mismo lote de LAR II cada vez. El LAR II preparado se puede almacenar de forma estable durante un mes a -20°C y durante un año a -70°C.
4. Los reactivos deben protegerse de la luz durante su almacenamiento y uso.
5. Para obtener los mejores resultados de medición, el tiempo desde la mezcla de la muestra y el reactivo de medición hasta la medición debe controlarse dentro del mismo tiempo posible (1-2 segundos).
6. No toque la pantalla de operación durante el uso (el programa finalizará o cancelará).
7. Intente no mover el instrumento en momentos normales para evitar que la pantalla táctil se mueva.