Observación morfológica de la apoptosis celular

2. Observación con microscopio electrónico de transmisión

3. Observación con microscopio de fluorescencia 1) Tinción con hematoxilina-eosina (He): el núcleo está picnótico y roto, azul Negro , citoplasma rojizo (células apoptóticas), los núcleos de las células normales son uniformes y de color azul claro o azul, y los núcleos de las células necróticas son de un azul extremadamente claro o azul y desaparecen.

2) Tinción de Giemsa, tinción de Wright, etc. , que muestra que los núcleos de las células normales tienen un color uniforme, las células apoptóticas se tiñen de forma más oscura y las células necróticas se tiñen ligeramente o no. 1) Las células se vuelven más pequeñas y se encogen por completo.

2) Los cuerpos apoptóticos son varios cuerpos redondos alrededor de las células. Las células apoptóticas se vuelven más pequeñas y se concentran en el citoplasma.

Los cambios morfológicos de la cromatina nuclear durante la apoptosis se pueden dividir en tres etapas: en la primera etapa, el núcleo se corruga o pliega, y parte de la cromatina se condensa; en la etapa ⅱa, la cromatina nuclear se condensa; muy condensado y los bordes son ionización; en el estadio IIb, el núcleo celular se fragmenta en fragmentos y forma cuerpos apoptóticos. Tintes fluorescentes de uso común: naranja de acridina, PI, DAPI, Hoechst33258, Hoechst33342, EB, etc.

La unión de Hoechst 33342, Hoechst 33258 y DAPI al ADN no está incrustada, principalmente en la región de la base A-T del ADN. Cuando se excita con la luz ultravioleta, emite una fluorescencia azul brillante.

1) Principio básico del método de doble tinción con PI

Hoechst es un tinte reactivo que se une específicamente al ADN, puede entrar en las membranas celulares normales y no es muy citotóxico para las células. La intensidad de fluorescencia de Hoechst 33342 en células apoptóticas es mayor que la de las células normales.

DAPI es semipermeable y se utiliza para la tinción rutinaria de células fijadas.

El yoduro de propidio (PI) es un colorante de ácido nucleico que no puede penetrar la membrana celular intacta. Sin embargo, en las etapas media y tardía de la apoptosis y la muerte, el PI puede penetrar la membrana celular y teñir el núcleo celular de rojo. . Por lo tanto, si la Anexina-V coincide con PI, se pueden distinguir las células apoptóticas tempranas y tardías y las células muertas. Principio: El derivado desoxinucleótido digoxina [(digoxigenina)-11-dutp] puede incorporarse en el extremo 3-OH del ADN bicatenario o monocatenario de células apoptóticas bajo la acción de la enzima TdT e interactúa con dATP para formar un heteropolímero. que se une a un anticuerpo anti-digoxigenina unido a una enzima informadora (peroxidasa o fosfatasa alcalina). En presencia de sustratos apropiados, la peroxidasa puede producir una reacción de color fuerte y puede localizar de manera específica y precisa células apoptóticas, por lo que se puede observar con un microscopio óptico común.

Digitalis es la única fuente de digoxina. Hay pocos ligandos que se unan a la antidigoxina en todos los tejidos animales, por lo que las respuestas inespecíficas son bajas. La reactividad cruzada de los anticuerpos específicos de digoxina con las hormonas esteroides de vertebrados es inferior al 65.438 ± 0%. Si la parte Fc de este anticuerpo se elimina mediante hidrólisis proteolítica, se puede descartar por completo la adsorción no específica de receptores Fc dentro de las células.

Este método se puede utilizar para determinar la apoptosis en secciones de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina, secciones congeladas y tejidos cultivados o aislados. 1. Tampón fosfato PBS (pH 7,4): fosfato sódico NaCl 50 mM NaCl 200 mM.

2. Proteinasa K (200μg/ml, pH 7,4): 0,02 g de Proteinasa K 100 ml.

3. Tampón PBS que contiene 2% de H2O2 (pH 7,4): H2O. 2 2,0 ml; tampón PBS 98,0 ml

4. Tampón enzimático TdT (preparación fresca): 3,63 g de base Trlzma ajustada a pH 7,2 con HCl 0,1 N, diluir a 1000 ml; luego, 29,96 gramos de sodio; Se añadieron arseniato de dimetilo y 0,238 gramos de cloruro de cobalto.

5. Solución de reacción de la enzima TdT: 32 μl de enzima TdT; 76 μl de tampón de enzima TdT, mezclar bien y colocar en hielo para su uso posterior.

6. Tampón de reacción de terminación del lavado: 17,4 g de cloruro de sodio; 8,82 g de citrato de sodio; 1000 ml de ddH2O

Solución de diaminobifenilo (DAB) al 7,0,05 %: DAB 5 mg; pH 7,4, filtrar antes de usar, añadir peróxido de hidrógeno al 0,02%.

8,0,5% verde de metilo (ph 4,0): 0,5 g de verde de metilo; 0,1 M de acetato de sodio 100 ml.

Butanol 9,100%, etanol 100%, 95%, 90%, 80%, 70% etanol, xileno, solución neutra de formaldehído 10%, ácido acético, agua de colofonia, etc.

10. Anticuerpo antidigoxigenina marcado con peroxidasa (ONCOR) 1. Pretratamiento de la muestra:

(1) Pretratamiento de secciones de tejido incluidas en parafina: las secciones se colocaron en un tanque de tinción y se lavó dos veces con xileno durante 5 minutos cada vez. Lavar dos veces con etanol absoluto, 3 min cada vez. Lavar una vez con etanol al 95% y al 75%, 3 minutos cada vez. Lavar con PBS durante 5 minutos, agregar solución de proteinasa K (20 ug/ml) e hidrolizar a temperatura ambiente durante 65438 ± 5 minutos para eliminar las proteínas del tejido. Enjuague 4 veces con agua destilada durante 2 minutos cada vez, luego siga el paso 2 a continuación.

⑵ Pretratamiento de secciones de tejido congelado: Coloque las secciones de tejido congeladas en formaldehído neutro al 10%, fije a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego retire el exceso de líquido. Lavar dos veces con PBS durante 5 minutos cada vez. Colóquelo en una solución de etanol:ácido acético (2:1) durante 5 minutos y trátelo a -20 °C durante 5 minutos para eliminar el exceso de líquido. Lave dos veces con PBS durante 5 minutos cada vez y siga el paso 2 a continuación.

⑶ Pretratamiento para cultivo o aislamiento de células: Fijar aproximadamente 5 × 107 células/ml en formaldehído neutro al 4% a temperatura ambiente durante 10 minutos. Deje caer 50 ~ 100 μl de suspensión celular en el portaobjetos de vidrio y seque. Lave dos veces con PBS durante 5 minutos cada vez y siga el paso 2 a continuación.

2. Añadir PBS que contenga peróxido de hidrógeno al 2% al tanque colorimétrico y reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Lavar dos veces con PBS durante 5 minutos cada vez.

3. Utilice papel de filtro para absorber cuidadosamente el exceso de líquido alrededor del tejido en el portaobjetos, agregue inmediatamente 2 gotas de tampón de enzima TdT a la sección y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 1 a 5 minutos.

4. Utilice papel de filtro para absorber cuidadosamente el exceso de líquido alrededor de las rodajas, agregue inmediatamente 54 μl de solución de reacción enzimática TdT a las rodajas y colóquelo en una caja húmeda para que reaccione a 37 °C durante 65438 ± 0 h (nota). : para control de tinción negativo, no añadir solución de reacción que contenga enzima TdT).

5. Coloque las rodajas en el tanque de tinción, agregue el tampón de lavado y parada de reacción precalentado a 37°C, incube a 37°C durante 30 minutos y levante y baje suavemente las rodajas cada 65438±00 minutos. . Deslizar y remover ligeramente el líquido.

6. Lave las secciones de tejido con PBS tres veces durante 5 minutos cada vez. Agregue dos gotas de anticuerpo antidigoxigenina marcado con peroxidasa directamente a las secciones y reaccione en una caja húmeda a temperatura ambiente durante 30 segundos. . minuto.

7. Lavar 4 veces con PBS, 5 minutos cada vez.

8. Agregue la solución DAB al 0,05 % recién preparada directamente a las secciones de tejido y desarrolle el color a temperatura ambiente durante 3 a 6 minutos.

9. Enjuague 4 veces con agua destilada, las primeras 3 veces durante 65438±0min cada vez y la última vez durante 65438±0min cada vez.

10, contrateñir con verde de metilo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Enjuague tres veces con agua destilada, tire del portaobjetos hacia arriba y hacia abajo 10 veces en las dos primeras veces y déjelo reposar durante 30 segundos la última vez. Lavar tres veces de la misma manera con 100% n-butanol.

11. Deshidratar con xileno 3 veces, 2 minutos cada vez. Después de sellar y secar, observar y registrar los resultados experimentales bajo un microscopio óptico. Asegúrese de tener configurados controles celulares positivos y negativos. Para los controles positivos, se pueden utilizar muestras parcialmente degradadas por DNasaI. Para los controles celulares positivos, se pueden tratar timocitos de rata y ratón o linfocitos de sangre periférica humana con dexametasona (1 μM) durante 3-4 horas. Los controles negativos no añaden enzima. , los demás pasos son los mismos que los del grupo experimental.

Después de un daño irreparable en el ADN, las células suelen sufrir una muerte programada o apoptosis. Pero este mecanismo es ineficaz en las células tumorales, por lo que pueden proliferar a voluntad y negarse a aceptar órdenes de "suicidio". Los científicos alemanes han descubierto una posible razón: las células tumorales degradan una proteína que desencadena la apoptosis. Inhibir la degradación de esta proteína puede restaurar el mecanismo apoptótico y mejorar la eficacia de la radioterapia y la quimioterapia. El artículo relacionado fue publicado en Nature Cell Biology.

Una de las proteínas que desencadena la apoptosis tras un daño severo en el ADN es la molécula HIPK2.

Thomas Hofmann, del Centro Alemán de Investigación del Cáncer, y sus colegas descubrieron que HIPK2 se produce constantemente en las células sanas, pero una enzima llamada Siah-1 lo marca como "basura", por lo que se degrada inmediatamente.

Las células ligeramente dañadas entrarán en un estado de alerta de bajo nivel, inhibiendo la degradación de HIPK2 durante un corto período de tiempo. Una vez reparado el daño, las células reanudan inmediatamente la degradación de HIPK2. Sólo en células gravemente dañadas (por ejemplo, ambas cadenas dobles de ADN están dañadas) se puede inhibir permanentemente la degradación de HIPK2. Como resultado, HIPK2 continúa acumulándose, provocando apoptosis y suicidio celular.

Los investigadores especulan que esta puede ser la razón por la que la radiación y la quimioterapia a veces fallan. Ambos tratamientos dañan gravemente las células tumorales y, en última instancia, provocan su muerte programada. Thomas Hofmann dijo: "Si hay resistencia a los medicamentos, a menudo es porque las células tumorales 'se niegan' a ejecutar la orden suicida".

En el experimento, los investigadores inhibieron la enzima Siah-1 y descubrieron que incluso en células ligeramente dañadas, HIPK2 puede acumularse y desencadenar la apoptosis. Hoffman especula: "La medicina contra el cáncer probablemente aprovechará este descubrimiento. Por ejemplo, podríamos usar inhibidores de Siah-1 en combinación con radiación o quimioterapia para hacer que las células vuelvan al mecanismo apoptótico.