Clonación molecular: un ejemplo
Hablando de clonación molecular, casi todos los que han construido plásmidos conocen el ensamblaje de Gibson. ¡Este método es tan popular! Recuerdo que cuando entré por primera vez al laboratorio, mis compañeros de último año me enseñaron que el método para construir plásmidos era el ensamblaje de Gibson. En ese momento, todos en el laboratorio usaban Gibson para el ensamblaje y me di cuenta de que el método clásico de ligadura de digestión enzimática aprendido en las clases de biología de la escuela secundaria y en las clases de biología de pregrado ya estaba desactualizado. Más tarde, leí mucha literatura y descubrí que, además del ensamblaje de Gibson, en realidad existen muchos métodos útiles de construcción de plásmidos. El ensamblaje de Golden Gate, que apareció casi al mismo tiempo que el ensamblaje de Gibson, es uno de ellos. Ambos métodos se pueden utilizar para una clonación perfecta.
El ensamblaje Golden Gate es un nuevo tipo de método de ligadura de digestión enzimática [1, 2], que es diferente del método tradicional de ligadura de digestión enzimática. La ligadura de enzimas de restricción tradicional utiliza enzimas de restricción estándar de tipo II (enzimas de restricción) como Eco RI para escindir el ADN. Estas enzimas de restricción generalmente reconocen palíndromos de 4 a 8 pb y se cortan dentro de la secuencia reconocida para producir extremos adhesivos o extremos romos (Figura 1A). El ensamblaje Golden Gate utiliza enzimas de restricción IIS como Bsa I para cortar el ADN. Estas enzimas de restricción reconocen secuencias no palindrómicas y las cortan fuera de la secuencia de reconocimiento para crear extremos pegajosos. (Figura 1B).
Figura 1II endonucleasa de restricción y endonucleasa de restricción IIS cortan el ADN.
Los extremos pegajosos producidos por el corte del ADN con la endonucleasa de restricción IIS suelen ser de 2 o 4 bases. En la reacción de ligación, cuanto mayor sea el número de bases en el extremo pegajoso, mayor será la fidelidad del producto de ligación. Por lo tanto, el ensamblaje Golden Gate generalmente utiliza endonucleasas de restricción IIS que pueden generar extremos adhesivos de 4 bases, como Bsa I, Bsm BI y Bbs I (Figura 2). NEB Company realizó modificaciones moleculares en estas tres endonucleasas de restricción de tipo salvaje y obtuvo tres endonucleasas de restricción con la misma secuencia de reconocimiento pero una especificidad más fuerte, a saber, Bsa I-HFv2, Bsm BI-v2 y Bbs (Fig. 2). La longitud de la secuencia de reconocimiento de estas enzimas de restricción es de 6 pb, por lo que la probabilidad de que aparezcan en la secuencia de ADN es 1/4096.
Figura 2 Las especificidades de las tres endonucleasas de restricción IIS
Como se muestra en la Figura 2, las especificidades de las tres enzimas de restricción tipo IIS se pueden registrar como BSA I (GGT tctc). 1/5), BSMB I (CGT tctc 1/5) y BBS I (GAAAGAC 2/6). Además, a menudo se utiliza la endonucleasa de restricción tipo IIS Sap I (GCTCTTC 1/4), que genera extremos adhesivos de 3 bases [3]. Aunque los extremos pegajosos generados por esta enzima de restricción son más cortos y la fidelidad del producto de ligación se verá ligeramente reducida, la secuencia de reconocimiento es más larga (7 pb), por lo que la probabilidad de que aparezca en la secuencia de ADN es 1/65438+. Según el orden de los sitios de escisión, Bsa I, Bsm BI y Bbs I pueden producir 256 tipos de extremos adhesivos, y Sap I puede producir 64 tipos de extremos adhesivos.
Hay muchos kits de clonación basados en el ensamblaje Golden Gate en el mercado, pero todos son caros. Siempre recomiendo que compres tus propias enzimas y reactivos para preparar el sistema de reacción. Siempre que comprenda el principio de funcionamiento de los componentes de Golden Gate y el método de diseño experimental, no habrá ningún problema. Permítanme tomar Bsa I-HFv2 como ejemplo para hablar sobre cómo utilizar el ensamblaje Golden Gate para construir plásmidos.
Diseñar cebadores
Introducir la secuencia de reconocimiento de Bsa I mediante PCR, y añadir la secuencia de reconocimiento en el extremo 5’ del cebador. Para garantizar que la endonucleasa de restricción pueda unirse de manera estable al ADN bicatenario y realizar la función de corte, se debe agregar una base protectora al final de la secuencia de reconocimiento. El número y tipo de grupos protectores no están fijados. Para simplificar el diseño del cebador, podemos usar TTT como base protectora (3 pb son suficientes para la mayoría de las endonucleasas de restricción. Si es por razones de seguridad, la base protectora se puede aumentar a 6 pb. Debido a que el sitio de escisión está aguas abajo de la secuencia de reconocimiento , puede ser cualquier secuencia, por lo que existen tres métodos diferentes de diseño de cebadores, como se muestra en la Figura 3.
Figura 3 Tres estrategias para diseñar cebadores: N representa cualquier base, 1234 y 5678 representan dos sitios de corte diferentes. Puede utilizar la secuencia existente de la plantilla de PCR o cebador para introducir N y los sitios de corte.
Principio experimental
(1) Conexión de dos fragmentos de ADN
Figura 4 El componente de la puerta dorada conecta dos fragmentos.
(2) Conexión de cuatro fragmentos de ADN
Figura 5 El conjunto Golden Gate conecta cuatro fragmentos: 1234, 5678, ABCD y efgh representan cuatro sitios de escisión diferentes.
Las dos imágenes anteriores muestran los principios de funcionamiento de la conexión de 2 segmentos y de la conexión de 4 segmentos respectivamente. Las conexiones de otros segmentos son similares. La digestión y ligación enzimática se realizan en el mismo sistema de reacción, y el producto de la PCR se puede usar como sustrato (Figura 4 y Figura 5), o el producto de la PCR se puede clonar primero en un vector plasmídico y luego se puede usar el plásmido. como sustrato. Bajo condiciones y diseño experimentales apropiados, se pueden ensamblar más de 20 fragmentos de ADN utilizando Golden Gate Assembly. El breve vídeo a continuación puede ayudarle a aprender más sobre cómo funciona el montaje del Golden Gate.
Principio de funcionamiento de los componentes de Golden Gate
Proceso de operación
(1) Preparación del sistema de reacción
①La cantidad de cada inserto puede ser Para la conversión basada en la cantidad de soporte agregado y la longitud del soporte y del inserto, se proporciona una herramienta de conversión aquí /#!/ligation;? ②Otras endonucleasas disponibles: BsmBI-v2 (NEB #R0739, 10U/?l), BbsI-HF (NEB #3539, 10U/?l), Sarpi (NEB #R0569, 10U/?l); es 1~10, use 10 unidades; si el número de fragmentos insertados es mayor que 10, use 20 unidades ④Si el número de fragmentos insertados es 1~10, use 500 unidades;; 10, utilice 500 unidades; si el número de fragmentos es mayor que 10, se utilizarán 1000 unidades.
(2) Procedimiento de reacción
Nota: 37°C es la temperatura de reacción óptima para BsaI-HFv2. Si se utilizan otras enzimas de restricción, es posible que sea necesario ajustar esta temperatura. Por ejemplo, la temperatura óptima para BsmBI-v2 es 42°C.
Ventajas
En comparación con la ligadura de endonucleasa de restricción tradicional
(1) El sitio de escisión de la endonucleasa de restricción IIS se encuentra entre la secuencia de reconocimiento. Además, la secuencia de reconocimiento es se eliminan durante el proceso de digestión enzimática y no se introducen secuencias innecesarias en el producto de ligación.
(2) La endonucleasa de restricción IIS no requiere la secuencia del sitio de escisión, por lo que se pueden generar diferentes extremos adhesivos diseñando la secuencia del sitio de escisión, lo que permite ensamblar direccionalmente múltiples fragmentos.
(3) Dado que la secuencia de reconocimiento no permanecerá en el producto de ligación, la reacción de digestión y la reacción de ligación se pueden llevar a cabo en el mismo sistema de reacción, simplificando el proceso experimental.
En comparación con el ensamblaje de Gibson
(1) El proceso de ligación de fragmentos no implica degradación ni síntesis de secuencia, por lo que la fidelidad del producto de ligación es mayor.
(2) Puede ensamblar más fragmentos de ADN y es adecuado para bibliotecas de plásmidos.
(3)? Se pueden ensamblar fragmentos de ADN con secuencias homólogas o secuencias repetidas. Por ejemplo, se pueden usar para construir plásmidos que expresen múltiples sgRNA [4].
(4)? Se pueden construir componentes biológicos sintéticos estandarizados, similares a los bioladrillos.
Cosas a tener en cuenta
(1) Se debe seleccionar una endonucleasa de restricción adecuada y la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción no puede aparecer en el producto de ligadura final.
(2) Al diseñar cebadores, la dirección de la secuencia de reconocimiento y el sitio de corte deben ser correctos.
(3) Cuando el número de fragmentos insertados es grande, para garantizar la especificidad de la conexión, la secuencia de 4 pb del sitio de corte debe diseñarse racionalmente.
La Tabla S7 en la referencia [5] proporciona combinaciones de secuencias optimizadas de sitios de escisión.
Referencias:
[1] ¿Engler et al. (2008)? ¿Más uno? 3,e3647.
Método de clonación de precisión en un solo paso con capacidades de alto rendimientodx.doi.org
[2] ¿Engler, C. et al. ¿Más uno? 4, e5553.
Barajado de Golden Gate: un método de barajado de ADN en un solo recipiente basado en la restricción de tipo II Enzymesdx.doi.org
[3] ¿Whitman, L. et al. Ginette. Inglés. Biotecnología. ? 33, 42.
(PDF) Clonación rápida y sin cicatrices de fragmentos de genes utilizando System.www.researchgate.net Elect vector
[4] Vad-Nielsen, j. (2016)? Moléculas celulares. ciencias de la vida. ? 73, 4315–4325.
https://doi.org/10.1007/s 00018-016-2271-5 doi.org
[5] HamediRad, M. et al (2019)? Sintetizador ACS. biología. ? 8, 1047–1054.
Puerta dorada eficiente y sin cicatrices de un solo recipiente Assemblydoi.org