¿Qué es la hibridación de moléculas de ácido nucleico?

En la investigación oncológica, para detectar la naturaleza y cantidad del gen a analizar o su producto de expresión, a menudo se requiere tecnología de hibridación molecular de ácidos nucleicos. La tecnología de hibridación de moléculas de ácido nucleico generalmente se puede dividir en dos tipos, uno es la hibridación de espacio estrecho y el otro es la hibridación por transferencia. La hibridación de espacio estrecho ahora rara vez se utiliza debido a su escasa precisión en la adición de muestras y su mala conductividad. La hibridación por transferencia por transferencia también se divide en dos tipos, una es la hibridación por transferencia Southern, que se usa para detectar muestras de ADN y la otra es la hibridación por transferencia Northern, que se usa para detectar muestras de ARN. Introduzca brevemente los principios, precauciones y aplicaciones de estas tecnologías.

(1) La hibridación por transferencia Southern utiliza enzimas de restricción apropiadas para cortar una cierta cantidad de muestra de ADN en fragmentos de ADN de diferentes longitudes y luego realiza una separación por electroforesis en gel de agarosa, como la cantidad de muestra agregada. son iguales y la digestión enzimática es apropiada, entonces cuando se tiñen con bromuro de etidio, se deben mostrar tiras de arrastre de ADN de igual longitud y brillo. El gel después de la electroforesis debe tratarse con desnaturalización alcalina para disociar el ADN en hebras individuales y luego usar sifón capilar o electrotransferencia para transferir los fragmentos de ADN monocatenario del gel a nitrocelulosa en la misma posición en el gel. se puede utilizar para la hibridación después de un lavado, secado y calentamiento adecuados en un horno a 80°C durante 2 horas. Las sondas conocidas para detectar ADN se preparan generalmente a partir de plásmidos bacterianos que portan el fragmento. El ADN de la sonda purificada generalmente se marca con el isótopo radiactivo 32P o biotina, digoxigenina, etc. La sonda debe calentarse a 100 °C para su desnaturalización antes de la hibridación. Después de que la membrana hibridada se somete a autorradiografía en un casete, se muestra en una posición determinada una banda de ADN positiva que se une específicamente a la sonda marcada. La hibridación por transferencia Southern puede detectar la presencia y amplificación de oncogenes, así como la pérdida de heterocigosidad de genes supresores de tumores.

(2) Hibridación por transferencia Northern El principio de la hibridación por transferencia Northern es básicamente el mismo que el de la hibridación por transferencia Southern. La diferencia es que el ARN es mucho menos estable que el ADN y la RNasa lo degrada fácilmente. La RNasa no solo está ampliamente disponible, sino que tampoco puede inactivarse calentándola a 100 °C. Por lo tanto, se requieren todos los utensilios y soluciones utilizados cuando se opera el ARN. Después de un tratamiento estricto para eliminar la RNasa. Además, la electroforesis de ARN debe realizarse en un gel desnaturalizante que contenga formaldehído o glioxal. La hibridación por transferencia Northern se utiliza principalmente para detectar la sobreexpresión de oncogenes u otros genes relacionados con tumores, y también puede detectar la expresión baja o nula de genes supresores de tumores.