Después de amplificar el gen diana mediante PCR, ¿cómo recuperarlo y purificarlo mediante electroforesis en agarosa? Espero que los expertos puedan darme algún consejo!
Se puede utilizar un kit de recuperación. Los ejemplos son los siguientes:
El ADN se recupera utilizando el kit de recuperación de gel de ADN AxyPrep de AXYGEN. Los pasos de recuperación son los siguientes:
1. Corte el gel de agarosa que contiene el ADN objetivo bajo luz ultravioleta. Ligero, use toallas de papel para absorber el líquido en la superficie del gel y córtelo en pedazos. Calcule el peso del gel (registre el peso del tubo de centrífuga de 1,5 ml con anticipación) y use este peso como volumen de gel (como 100 mg = 100 μl de volumen);
2. volúmenes de gel de Buffer DE-A. Mezcle uniformemente y caliente a 75 °C. Mezcle intermitentemente (cada 2-3 minutos) hasta que el bloque de gel se derrita por completo (aproximadamente 6-8 minutos);
3. Agregue 0.5 Buffer DE-B, mezcle uniformemente;
4. Aspire la solución mezclada en el paso 3, transfiérala a un tubo de preparación de ADN (colóquelo en un tubo de centrífuga de 2 ml (incluido en el kit)) , centrifugar a 12.000 xg durante 1 min y desechar el filtrado;
5. Colocar el tubo de preparación nuevamente en un tubo de centrífuga de 2 ml, añadir 500 μl de tampón W1, centrifugar a 12.000 xg durante 30 s. desechar el filtrado;
6. Vuelva a colocar el tubo de preparación en un tubo de centrífuga de 2 ml, agregue 500 µl de tampón W2, centrifugue a 12 000 xg durante 30 s, deseche el filtrado y lave una vez con 700 µl de tampón W2. de la misma manera y centrifugar a 12.000 × g durante 1 min.
7. Preparar Coloque el tubo nuevamente en un tubo de centrífuga de 2 ml y centrifugue a 12.000 × g durante 1 min;
8 Coloque el tubo de preparación en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml (incluido en el kit) y agregue de 25 a 30 µl de eluyente, déjelo reposar a temperatura ambiente durante 1 min y centrifugue a 12 000 xg durante 1 min. eluir el ADN.
Si el fragmento es más grande, como varios miles de kb o más, se recomienda utilizar el kit de recuperación de Promega Company, que tiene mejor efecto.
Los pasos específicos y otros kits de recuperación se proporcionan con instrucciones.