Suplemento científico: El COVID-19 y sus variantes en la saliva se pueden detectar de forma rápida y precisa en casa.
Ahora, en un nuevo estudio, investigadores del Instituto Weiss de Ingeniería Biológica de la Universidad de Harvard, el MIT y varios hospitales de Boston han desarrollado una prueba de diagnóstico económica basada en CRISPR que permite a los usuarios probar el nuevo coronavirus y sus diversas variantes virales en casa sin necesidad de instrumentos adicionales. Los resultados de la investigación relevante se publicaron en la revista Science Advances el 6 de agosto de 2021. El artículo se titula "Diagnóstico Sherlock instrumentado mínimo para el nuevo coronavirus en el lugar de atención y fusión de variables basadas en Crispr".
El dispositivo de diagnóstico, llamado MinimallyInstrumentedSHERLOCK, es fácil de usar y proporciona resultados que pueden leerse y verificarse mediante una aplicación de teléfono inteligente compatible en una hora. Distinguió con éxito tres variantes diferentes del nuevo coronavirus en experimentos y puede reconfigurarse rápidamente para detectar variantes adicionales, como la variante Delta. El dispositivo se puede montar utilizando una impresora 3D y piezas comunes por unos 15 dólares. Reutilizar estos componentes puede reducir el costo de una sola prueba a $6.
Helenade Puig, primera autora del artículo e investigadora postdoctoral en el Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica de la Universidad de Harvard y el MIT, afirmó: "miSHERLOCK elimina la necesidad de transportar muestras de pacientes a sitios de pruebas centralizados, lo que en gran medida mejora la eficiencia de las pruebas." Los pasos simplificados de preparación de muestras brindan a los pacientes y médicos una imagen más rápida y precisa de la salud de las personas y las comunidades, lo cual es importante en una epidemia en evolución. "
De la cadena de suministro a Sherlock
Como pediatra especializada en enfermedades infecciosas en el Boston Children's Hospital, la Dra. Rose Lee, primera autora del artículo * * *, ha estado trabajando en la primera línea de la epidemia de neumonía por coronavirus-19 durante más de un año. Su experiencia en la clínica sirvió de inspiración para el eventual desarrollo del programa Misherock.
Lee dijo: “Algunas cosas simples que solían ser omnipresentes en los hospitales, como los hisopos nasofaríngeos, de repente se volvieron difíciles de obtener, por lo que los procedimientos de procesamiento de muestras de rutina se vieron interrumpidos, lo cual es un gran problema en el contexto. de la epidemia. La gran pregunta. La motivación de nuestro equipo para este proyecto es eliminar estos cuellos de botella y proporcionar diagnósticos precisos para COVID-19 sin depender demasiado de las cadenas de suministro globales, y al mismo tiempo detectar con precisión las variantes del virus emergentes. >Para la parte de detección del nuevo coronavirus de su dispositivo de diagnóstico, los autores eligieron la tecnología basada en CRISPR, que fue construida por el autor del artículo, el Dr. Jim Collins, miembro principal de la facultad del Instituto Weiss de Ingeniería Biológicamente Inspirada de la Universidad de Harvard, llamado Sherlock. Sherlock utiliza las "tijeras moleculares" de CRISPR para cortar ADN o ARN en sitios específicos, lo que tiene un beneficio adicional: este tipo específico de tijeras moleculares también corta otros fragmentos de ADN en el área circundante, lo que le permite cortar el ADN que transporta la señal fluorescente. moléculas sonda de ácido nucleico de cadena doble, produciendo así una señal fluorescente que indica que la diana se ha escindido con éxito.
El procedimiento de diagnóstico simplemente requiere que el usuario escupa en la cámara de preparación de muestras, luego transfiera la bandeja de recolección a la cámara de reacción y presione el émbolo, activando así la reacción y minimizando el riesgo de contaminación cruzada. Imagen de Science Advances, 2021, DOI: 10.1126/sciadv.abh 2944.
Los autores crearon una prueba de Sherlock diseñada para escindir una región específica del gen que codifica la nucleoproteína del nuevo coronavirus que se conserva entre las muchas variantes del virus. Cuando esta tijera molecular, llamada Cas12a, se une y corta con éxito el gen NP, también se cortan las sondas de ADN monocatenarias cercanas, produciendo una señal fluorescente.
También crearon una prueba de Sherlock adicional para apuntar a un conjunto de mutaciones virales en la secuencia de la proteína de pico que representa las tres nuevas variantes del coronavirus: alfa, beta y gamma.
Con un ensayo que puede detectar de forma fiable el ARN viral dentro del rango de concentración aceptable de las pruebas de diagnóstico autorizadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU., los autores se centraron en resolver los desafíos más difíciles del diagnóstico: la preparación de muestras.
Quejarse, esperar, escanear
El artículo * * * y el primer autor, el Dr. Tan Xiao, investigador clínico del Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada de la Universidad de Harvard, dijo: "Cuando probar la muestra Cuando se trata de ácidos nucleicos, es necesario seguir muchos pasos para preparar la muestra de modo que realmente pueda extraer y amplificar esos ácidos nucleicos, y debe proteger la muestra cuando la transporta a un centro de prueba. instalación, y si se trata de una enfermedad infecciosa, asegúrese de que no sea contagiosa. Para que sea una prueba de diagnóstico realmente fácil de usar, tuvimos que hacerlo lo más simple posible".
Estos autores optaron por utilizar muestras de saliva en lugar de hisopos nasofaríngeos como método de recolección porque es más fácil para los usuarios recolectar saliva y las investigaciones muestran que el nuevo coronavirus se puede detectar en la saliva más días después de la infección. Sin embargo, la saliva no procesada presenta sus propios desafíos: contiene enzimas que degradan varias moléculas, lo que genera una alta tasa de falsos positivos.
Estos autores desarrollaron una nueva técnica para solucionar este problema. Primero, agregaron dos químicos, DTT y EGTA, a la saliva y calentaron la muestra a 95 C3 durante 3 minutos, lo que eliminó las señales falsas positivas en la saliva no tratada y lisaron cualquier partícula viral. Luego agregaron una membrana porosa para capturar el ARN en su superficie, que luego podrían agregar directamente a una reacción de Sherlock para producir resultados de la prueba.
Para integrar la preparación de muestras de saliva y la reacción de Sherlock en un dispositivo de diagnóstico, estos autores diseñaron un dispositivo simple que funciona con baterías con dos cámaras: una cámara de preparación de muestras calentada y una cámara de reacción no calentada. El usuario escupe en la cámara de preparación de muestras, la calienta y espera de tres a seis minutos hasta que la saliva entre en el filtro. El usuario retira el filtro y lo transfiere a la columna en la cámara de reacción, luego presiona el émbolo, coloca el filtro en la cámara de reacción y perfora el depósito para activar la reacción de Sherlock. Después de 55 minutos, el usuario observa la cámara de reacción a través de la ventana transparente tintada para confirmar si hay una señal fluorescente. También pueden utilizar una aplicación de teléfono inteligente correspondiente para analizar los píxeles grabados por la cámara del teléfono inteligente y proporcionar un diagnóstico claro positivo o negativo.
Los autores probaron su dispositivo de diagnóstico en muestras clínicas de saliva de 27 pacientes con COVID-19 y 21 pacientes sanos y descubrieron que miSHERLOCK podía identificar correctamente a los pacientes con COVID-19 positivo el 96% de las veces e identificar correctamente la enfermedad. pacientes gratuitos el 95% del tiempo. También probaron el rendimiento del dispositivo de diagnóstico en la detección de variantes alfa, beta y gamma-CoV-2 del SARS-CoV-2 añadiendo ARN viral sintético de longitud completa que contiene mutaciones representativas de cada variante del virus a la saliva humana sana y descubrieron que el dispositivo era eficaz. en una amplia gama de concentraciones de ARN viral.
* * * Devora Najjar, primera autora e investigadora asociada en el laboratorio de Collins, dijo: "Una ventaja de miSHERLOCK es que es completamente modular. El dispositivo en sí está desacoplado del método de detección, por lo que puede combine diferentes métodos de detección para detectar la secuencia específica de ARN o ADN que desea detectar. El costo de este dispositivo será de aproximadamente $ 15, pero cuando se produzca en masa, el método de detección para el nuevo objetivo se puede reducir a aproximadamente $ 3. en aproximadamente dos semanas, esto permite el rápido desarrollo de nuevos métodos de detección de variantes para enfermedades como el COVID-19”
Prepárense para aplicaciones prácticas
Estos autores afirmaron en Su equipo de diagnóstico estaba. construido teniendo en cuenta entornos de bajos recursos, mientras la pandemia arroja luz sobre las enormes desigualdades en la atención médica entre diferentes partes del mundo. Los componentes del dispositivo pueden ser fabricados por cualquier persona que sepa cómo utilizar una impresora 3D, y los archivos de datos y diseños de circuitos relevantes están disponibles públicamente en Internet. Agregar aplicaciones para teléfonos inteligentes también está dirigido a entornos con recursos limitados, ya que el servicio de telefonía móvil está disponible en casi cualquier parte del mundo, incluso en áreas a las que es difícil llegar a pie. Están ansiosos por asociarse con fabricantes interesados en producir miSHERLOCK en masa para su distribución global.
Collins dijo: “Cuando comenzó el proyecto miSHERLOCK, había poco seguimiento de las nuevas variantes del coronavirus. Sabemos que el seguimiento de esta variante será difícil de evaluar a medida que evaluamos el impacto a largo plazo del COVID-19. Las variantes virales van a ser muy importantes, por lo que nos esforzamos por construir una plataforma de diagnóstico verdaderamente descentralizada, flexible y fácil de usar. Al resolver el problema de la preparación de muestras, nos aseguramos de que este dispositivo estuviera realmente disponible para todos. consumidores, y estamos entusiasmados de trabajar con socios industriales "Al combinar biotecnología de vanguardia con materiales de bajo costo, este equipo de investigación estableció un poderoso dispositivo de diagnóstico que puede ser fabricado y utilizado localmente por personas sin títulos médicos avanzados. ejemplo perfecto de la misión del Instituto Weiss de Bioingeniería de Harvard: poner innovaciones que cambian vidas en manos de quienes las necesitan”
Referencias:
Helena Nard Puigtal. Sherlock mínimamente instrumentado para el diagnóstico en el lugar de atención del SARS-CoV-2 basado en CRISPR y la caracterización de variantes. Avances científicos, 2021, doi:10.1126/sciadv.abh2944.