Cómo leer los resultados del diseño del cebador de primer5

Detecte los parámetros de diseño del cebador a través de los parámetros del cebador: la longitud de un cebador es generalmente de alrededor de 20 pb, y la longitud de las bases de los cebadores aguas arriba y aguas abajo no debe diferir en más de 4 bases.

b La temperatura de recocido del cebador es generalmente de 58 grados. Cada software TM utiliza diferentes algoritmos. Primer3, primer5, primer6, primerexpress, etc. generalmente se pueden configurar entre 55 y 58 grados, y beacondesign se puede configurar en aproximadamente 58 grados. 65.

Generalmente no existen requisitos especiales para el contenido de cGC, lo mejor es 40-60. Si no es fácil de diseñar, 30-80 también es aceptable.

La longitud del producto d es de 100-150, 80-200, pero no alrededor de 50 pb, lo que será difícil de distinguir del cebador-dímero. Si supera los 200 pb, puede afectar a la amplificación por PCR. .

Los cebadores proporcionados por el software no pueden tener una estructura de horquilla y coincidir con más de 3-4 bases, especialmente el extremo 3' no puede tener una base coincidente, lo que facilitará la formación de dímeros.

Después de diseñar los cebadores f, realice una explosión de cebador en NCBI para comprobar si hay amplificación no específica.

Es mejor verificar mediante experimentos si la curva de fusión del cebador de PCR cuantitativo a es un pico único, estrecho y nítido, de lo contrario puede haber una amplificación no específica;