Metilación del ADN
La metilación del ADN es un proceso en el que se añaden grupos metilo a determinadas bases mientras la secuencia del ADN permanece sin cambios. El resultado de la metilación del ADN es generalmente una reducción en la expresión de genes aguas abajo del sitio metilado.
La familia de las ADN metiltransferasas (Dnmts) cataliza la transferencia de un grupo metilo de la S-adenina metionina (SAM) al quinto carbono de un residuo de citosina para formar 5-metilcitosina (5mC).
(a) Dnmt3a y Dnmt3b son Dnmts de novo y transfieren grupos metilo (rojo) al ADN desnudo.
(b) Dnmt1 mantiene Dnmt y mantiene los patrones de metilación del ADN durante la replicación. Cuando el ADN sufre una replicación semiconservadora, la estructura de ADN parental conserva el patrón de metilación del ADN original (gris). Dnmt1 se asocia con focos de replicación y replica con precisión el patrón de metilación del ADN original agregando grupos metilo (rojo) a las hebras hijas recién formadas (azul).
La metilación del ADN, junto con las modificaciones de histonas y microARN (miARN), regula la transcripción. En los eucariotas, el ADN se une a las histonas, que ayudan a empaquetar largas cadenas de ADN en pequeños dominios nucleares. Se añaden modificaciones químicas que incluyen metilación, acetilación, ubiquitinación y fosforilación a tres aminoácidos específicos en la cola de histona N-terminal. Estas modificaciones no sólo afectan a cómo se empaqueta la cadena de ADN, sino también a su actividad transcripcional. Las modificaciones de histonas que unen débilmente el ADN a las histonas generalmente proporcionan un ambiente permisivo para la transcripción, mientras que las modificaciones de histonas que empaquetan estrechamente el ADN y las histonas inhiben la expresión genética. Los dnmts interactúan directamente con enzimas que regulan las modificaciones de las histonas que normalmente participan en la represión genética. Se sabe que tanto Dnmt1 como Dnmt3a se unen a la histona metiltransferasa SUV39H1, que restringe la expresión génica mediante la metilación en H3K9. Además, tanto Dnmt1 como Dnmt3b pueden unirse a la histona desacetilasa para eliminar la acetilación de las histonas, lo que hace que el ADN esté más empaquetado y limita la entrada de la transcripción. Normalmente, los Dnmts cooperan con enzimas modificadoras de histonas implicadas en la adición y/o eliminación de marcas de histonas para imponer un estado represivo en las regiones genéticas.
Tratar el ADN con bisulfito. En el ADN, las bases C que no están metiladas o hidroximetiladas se convertirán en bases U.
En condiciones débilmente ácidas, el bisulfito se unirá a la posición 6 de la base C no metilada. La base C metilada no reaccionará con el bisulfito. Luego trátelo con álcali. El C no metilado unido al bisulfito se desamina y se desulfita. Luego, se convierte en base U. Las bases C metiladas o hidroximetiladas siguen siendo "C".
El tratamiento del ADN con bisulfito puede convertir alrededor del 99% de las bases C no metiladas en U. En otras palabras, la eficiencia de conversión de este método es muy alta, alcanzando el 99%.
El ADN que ha sido convertido mediante bisulfito se somete a continuación a PCR. En la cadena recién sintetizada mediante PCR, la posición de la base U se sustituirá por "T". Luego, en el proceso de secuenciación posterior, también se detectará la base T. Dado que el bisulfito no convierte el C metilado, la base "C" aún se detecta durante el proceso de secuenciación posterior.
Proceso de construcción de biblioteca de metilación.
El primero es el método de construcción de la biblioteca de ADN Truseq de Illumina.
Porque en el kit de construcción de la biblioteca de ADN Illumina Truseq, las bases C de los conectores proporcionados han sido metiladas. Por lo tanto, en la biblioteca hecha con estos enlazadores, durante el proceso de conversión con bisulfito, su C (en el enlazador) permanecerá C y no se convertirá en U. Las moléculas de la biblioteca con estos adaptadores pueden hibridarse de forma complementaria con el ADN del césped en el chip de secuenciación. Y se produce una reacción de PCR puente adicional. Generar grupos de ADN para secuenciar. Sin embargo, este método tiene una desventaja, que es que cuando la biblioteca de ADN se trata con bisulfito, más del 90% de las cadenas de ADN se romperán. De esta forma se destruirá el 90% de las moléculas de la biblioteca ya construida. En otras palabras, la riqueza de la biblioteca se perderá en más del 90%.
Su ventaja es que se utilizan menos ciclos de PCR en el proceso de construcción de la biblioteca. Por lo tanto, su eficiencia de amplificación por PCR es diferente y el grado de biblioteca desigual causada por ella es bajo. Eso es lo que solemos llamar menos sesgo de PCR.
El segundo es el método EpiGnome desarrollado por EpiCentre.
En el primer paso, el bisulfito primero trata el ADN y convierte todo el C no metilado en U.
En el paso 2, añade el cebador aleatorio con la etiqueta 1 y realiza la primera replicación. Obtenga la cadena de copias del elemento 1.
Paso 3, digerir el exceso de primers.
Paso 4, añade un cebador aleatorio con base de tope terminal y etiqueta 2. La función de este cebador es extender la primera copia de la cadena y agregar la etiqueta 2.
Paso 5, añadir los cebadores de PCR para la construcción de la biblioteca y realizar la PCR. Mediante PCR, se añaden secuencias índice y secuencias de cebadores agrupados a ambos lados de la cadena. Obtenga la biblioteca real.
La ventaja de este método es que el proceso de tratamiento con bisulfito se sitúa antes de la construcción de la biblioteca. La riqueza de la biblioteca construida de esta manera será relativamente alta. Pero la desventaja es que se requieren más ciclos de PCR. Después de más ciclos de PCR, la uniformidad de amplificación de los productos de PCR no es muy buena. En otras palabras, el sesgo de la PCR será relativamente grande.
Debido a que la biblioteca de metilación ha sido tratada con bisulfito, la mayoría de las C se han cambiado por T. Por lo tanto, esta biblioteca carece gravemente de bases C, es decir, la proporción de las cuatro bases está gravemente desequilibrada. De esta manera, durante el proceso de uso del secuenciador HiSeq 2000 o 2500 para medir bibliotecas de metilación, la calidad de los datos obtenidos mediante la secuenciación de bibliotecas será deficiente. Y el rendimiento de datos efectivo obtenido mediante el filtrado PF también será menor. Para compensar el desequilibrio de bases de la biblioteca de metilación, en circunstancias normales, una gran proporción de la biblioteca genómica o biblioteca PhiX se incorpora durante el proceso de informatización para complementar más bases C, normalmente el 30% de la biblioteca PhiX o biblioteca genómica. En las condiciones de incorporación del 30 % de la biblioteca PhiX, un carril HiSeq 2000 V3 PE100 puede obtener aproximadamente 20 G de datos de la biblioteca de metilación. En otras palabras, en la plataforma HiSeq 2000 o 2500, la producción de datos de secuenciación de las bibliotecas de metilación nunca ha sido muy alta. La calidad también es menor.