19 Problemas de duplicación técnica de secuenciación de alto rendimiento en RNA-Seq

¿Necesitamos réplicas técnicas en RNA-Seq? No hay necesidad de réplicas técnicas si tenemos réplicas biológicas. ¿Por qué?

Ahora imagina que podemos hacer RNA-seq sin ninguna variación técnica. Ahora secuenciamos el gen X en algunos ratones y obtenemos las lecturas de X. En la siguiente figura, dado que no hay repetición técnica, la diferencia en las lecturas del gen X entre la muestra 1 y la muestra 2 proviene de la variación biológica.

Secuenciamos el gen X de todos los ratones del planeta y obtuvimos las lecturas, y utilizamos la letra griega μ para representar el promedio de todos los genes Xreads. Luego encuentre la diferencia entre las lecturas de cada ratón y las lecturas promedio de todos los ratones.

Supongamos que solo calculamos 5 muestras. En este momento, usamos fórmulas matemáticas para representar las lecturas de los primeros cinco ratones y luego calculamos el promedio de las lecturas de estos 5 ratones.

Luego simplificamos la fórmula. El lado izquierdo es μ y el lado derecho es una constante, que tenderá a 0 a medida que aumenta el tamaño de la muestra.

Para aclarar las cosas, las variaciones biológicas están en naranja y las variaciones técnicas están en verde. Una flecha verde que apunta hacia abajo indica una disminución en las lecturas debido a una variación técnica, y una flecha verde que apunta hacia arriba indica un aumento en las lecturas. debido a variaciones técnicas. Usamos fórmulas matemáticas para representar las lecturas de los primeros cinco ratones y luego calculamos el promedio de las lecturas de estos cinco ratones.

Como antes, con más muestras, ambos términos de cambio se acercarán a cero porque los valores en el numerador se cancelan entre sí.

? Primero, imaginemos que tenemos un ratón y lo secuenciamos 5 veces. La variación biológica es naranja y la variación técnica es verde. En este momento, usamos una fórmula matemática para expresar las lecturas de. Luego, las primeras cinco muestras se calculan como el promedio de las lecturas de estas cinco muestras.

En este caso, el número medio de lecturas del gen X en el primer ratón consta de 3 partes. La parte 1 es la media real μ, la parte 2 es la variación biológica, que es un valor fijo. La tercera parte es variación técnica, pero tenderá a 0 a medida que aumente la duplicación técnica.

Ahora, la muestra 1 tiene dos réplicas técnicas y la muestra 2 tiene 3 réplicas técnicas. Calcula el promedio de lecturas.

Echemos un vistazo a la lentitud con la que el término medio tiende a 0. Hicimos 3 réplicas técnicas del ratón 2, por lo que se necesitaron un total de 15 muestras para obtener el mismo término que 5 réplicas biológicas.