? Cultivo de tejidos vegetales y su aplicación en la investigación de la medicina herbaria china.
Por tanto, está demostrado que cada célula somática de la planta tiene el potencial de formar una planta completa. Por ejemplo, las células vegetales son totipotentes y se puede inducirlas a diferenciarse en órganos y regenerar plantas bajo ciertas condiciones en cultivo in vitro. Después de la década de 1970, la investigación sobre el cultivo de protoplastos vegetales y la hibridación de células somáticas se ha desarrollado enormemente. Por ejemplo, el tabaco, la datura, la belladona, la zanahoria y la colza pueden regenerarse a partir de sus protoplastos y diferenciarse en embriones o plantas completas. Las células híbridas de Nicotiana y Petunia pueden proliferar y diferenciarse en plantas híbridas mediante la fusión de protoplastos.
Por tanto, los métodos de cultivo de tejidos pueden utilizarse para estudiar la reproducción, el crecimiento y la diferenciación de células, tejidos u órganos y los efectos de diversos factores externos sobre ellos en condiciones relativamente simples y fáciles de observar, consiguiendo así Proporcionar soluciones a algunos problemas de la producción agrícola y farmacéutica abre amplias perspectivas. En la actualidad, se han aplicado varios resultados importantes en la práctica de producción. Uno de ellos es la rápida propagación de sistemas de propagación asexual, como la caña de azúcar. En el pasado, se utilizaban entre 0,5 y 1 tonelada de semillas de caña de azúcar por acre. Por poner otro ejemplo, la tasa de reproducción de Fritillaria es muy baja. Los bulbos diferenciados mediante cultivo de tejidos tardan unos tres meses, lo que equivale a los bulbos bienales propagados a partir de semillas. Otra es la producción industrial de medicamentos y productos biológicos. Los ingredientes activos de las plantas medicinales generalmente se extraen de las plantas, y su rendimiento y calidad se ven inevitablemente afectados por factores como la genética vegetal, las condiciones de crecimiento, el período de cosecha, el almacenamiento y el transporte. Estas deficiencias pueden superarse si se pueden producir ingredientes activos mediante métodos similares a los utilizados para producir antibióticos mediante el cultivo de microorganismos. Por ejemplo, en los últimos años se ha cultivado tejido de ginseng en grandes cantidades y se han extraído sus principios activos. Por lo tanto, utilizar el cultivo de tejidos para producir ingredientes medicinales y explorar el camino de la industrialización de la producción de medicamentos naturales son nuevas direcciones para la producción de medicamentos. Con el éxito de la tecnología de cultivo artificial a gran escala, se ha hecho posible utilizar el cultivo de tejidos en lugar de plantas enteras para extraer ingredientes activos. Este será uno de los temas centrales de las futuras investigaciones en medicina vegetal.
1. Composición y método de preparación del medio de cultivo
El medio de cultivo sintetizado químicamente utilizado en los últimos años consta de seis componentes: (1) carbohidratos, dos o más sales inorgánicas, (3) ) oligoelementos, (4) aminoácidos, amidas y purinas, (5) vitaminas, (5) vitaminas. 3. Auxina. Además, algunos medios de cultivo también pueden añadir jugos naturales, como leche de coco, extracto de levadura, caseína hidrolizada, extracto de malta, etc. Si se agrega 0,5 ~ 1 de agar al medio, es un medio sólido para cultivo estático; de lo contrario, es un medio líquido para cultivo en suspensión. Los diferentes materiales vegetales a menudo requieren fórmulas cambiantes, como mantener el crecimiento, inducir la división y diferenciación celular, etc., por lo que existen muchos tipos de fórmulas. Actualmente, Sra. (¿Murashige? Entonces qué. Skoog) La fórmula del medio es el medio básico más utilizado, que es beneficioso para el rápido crecimiento de células y tejidos vegetales en general.
En definitiva, la composición del medio de cultivo debe determinarse en función del propósito de la investigación y del tipo de plantas que se cultivan. Además de la nutrición y la inducción, también se debe prestar atención al equilibrio iónico y la toxicidad. Por ejemplo, generalmente se usa agua destilada para el agua y medicamentos químicamente puros para las sales inorgánicas. ¿Puede el pH ser 1N? ¿Solución de KoH (o NaOH) y 2N? Ajuste de HCI. A veces se pueden utilizar medicamentos comunes, pero cabe señalar que estos medicamentos no sólo deben tener valor nutricional, sino que además no deben ser tóxicos. Si se utilizan tanques grandes para cultivar células o tejidos en la industria para producir ingredientes activos y productos biológicos, la cantidad de medio de cultivo utilizado se medirá en tonelaje, por lo que se debe considerar cuidadosamente qué alternativa es más económica y práctica.
En segundo lugar, condiciones culturales
(1) Temperatura: para la mayoría de los tejidos vegetales, 20 ~ 28 ℃ pueden satisfacer las necesidades de crecimiento, y 26 ~ 27 ℃ es el más adecuado.
(2) Iluminación: El cultivo de tejidos se suele realizar bajo luz difusa. La influencia de la luz puede conducir a resultados diferentes.
Algunos tejidos vegetales crecen mejor en la oscuridad, mientras que otros crecen mejor en la luz. Cuando el callo se diferencia en órganos, requiere una cierta cantidad de luz todos los días para formar brotes y raíces. La formación de algunas sustancias menores está determinada por sólo tres factores.
(3) Presión osmótica: La presión osmótica está estrechamente relacionada con el crecimiento y diferenciación de los tejidos vegetales. La presión osmótica se puede ajustar añadiendo sal, sacarosa, manitol y etilenglicol al medio de cultivo. Generalmente, de 1 a 2 atmósferas de presión pueden favorecer el crecimiento de los tejidos vegetales. Cuando la presión atmosférica es superior a 2, aparecen obstáculos para el crecimiento y los tejidos vegetales no pueden sobrevivir a 6 presiones atmosféricas.
(4) Valor de pH: Generalmente, el valor de pH más adecuado para el crecimiento del tejido vegetal es 5 ~ 6,5. Durante el proceso de cultivo se puede cambiar el valor del pH y la adición de hidrogenofosfato o sal dihidrógena puede tener un efecto estabilizador.
(5) Ventilación: El crecimiento vigoroso de las células en cultivo en suspensión debe contar con buenas condiciones de ventilación. Cuando se cultiva una pequeña cantidad de suspensión, la rotación o agitación frecuente pueden influir en la aireación y la agitación. En cultivos a gran escala se pueden utilizar dispositivos especiales de aireación y agitación.
Tres. Materiales y métodos
Todas las especies y partes, desde algas inferiores hasta plantas superiores, como musgos, helechos y plantas con semillas, se pueden utilizar como materiales de cultivo de tejidos. Generalmente, las gimnospermas utilizan plántulas, yemas y células del floema, mientras que las angiospermas utilizan embriones, endospermo, cotiledones, plántulas, puntas de brotes, raíces, tallos, hojas, anteras, polen, ovarios y óvulos.
Debido a que en condiciones naturales las superficies de las plantas suelen estar contaminadas por moho y bacterias, por lo que es necesario desinfectar los materiales. Generalmente se utiliza una solución de polvo blanqueador (1 ~ 10), una solución de hipoclorito de sodio (0,5 ~ 10), una solución de cloruro de mercurio (0,01), etanol (70) o peróxido de hidrógeno (3 ~ 10). En condiciones adecuadas, una masa de tejido desdiferenciada, llamada callo, puede crecer rápidamente en la superficie de la incisión del tejido lesionado. Después de un cierto período de tiempo en un medio adecuado, se puede inducir a que crezca hasta convertirse en una planta completa. Por lo tanto, el callo no es sólo la fuente de ciertos metabolitos de las plantas, sino también una de las principales vías de inducción de las plantas.
En condiciones de cultivo adecuadas, los callos se pueden subcultivar durante mucho tiempo, lo que se denomina subcultivo. Sin embargo, en el subcultivo, a medida que aumenta el número de subcultivos, la capacidad de diferenciación de muchos tejidos o células vegetales disminuye gradualmente o incluso se pierde. Esto puede deberse al consumo gradual de sustancias especiales relacionadas con la formación de órganos en la matriz original durante el cultivo. Por lo tanto, este proceso puede restaurarse mediante hormonas o mediante la mejora de las condiciones nutricionales. Algunas personas piensan que se trata de un cambio genético en tejidos y células durante el cultivo a largo plazo, principalmente cambios cromosómicos, y aparece una gran cantidad de células poliploides o aneuploides, que pueden restaurarse. Diferentes medios de cultivo pueden hacer que los callos crezcan a diferentes ritmos y la estructura puede estar suelta o compacta. Utilizando estas propiedades, se puede dispersar en células individuales o en pequeños grupos de células. Para formar células individuales, es necesario cultivarlas en un medio con alto contenido de sal, auxina y caseína hidrolizada, y luego trasladarlas a un líquido y dispersarlas en células individuales mediante agitación. También es útil agregar algo de pectinasa, pero en general rara vez se obtienen células individuales puras.
A la hora de seleccionar materiales para el cultivo de plantas medicinales, también se debe tener en cuenta el lugar de síntesis de las sustancias secundarias necesarias en la planta. Si los materiales y métodos de cultivo son apropiados, los principales metabolitos producidos en la planta original pueden obtenerse mediante transformación bioquímica en cultivo de células o tejidos.
Los ingredientes activos se pueden obtener mediante cultivo de tejidos, pero en realidad sólo el cultivo exitoso en grandes cantidades tiene valor económico. Por lo tanto, en la producción se utiliza a menudo el cultivo en suspensión en lugar de medios sólidos que contienen agar. Los callos en cultivos en suspensión generalmente crecen más rápido que en cultivos estacionarios porque los nutrientes pueden penetrar en las células más rápidamente, los productos de desecho metabólicos que inhiben el crecimiento se pueden eliminar más rápidamente y el suministro de oxígeno es mejor. Durante este proceso de cultivo, se debe prestar atención a la ventilación y la actualización periódica de la solución nutritiva, que es una de las claves para garantizar un crecimiento estable y una alta producción de biomasa secundaria.
En cuarto lugar, la formación de principios activos
Enumera algunos principios activos sintetizados mediante cultivo de tejidos.
El uso del cultivo de tejidos para producir ingredientes medicinales se ha convertido gradualmente en una de las nuevas direcciones en la producción de fármacos.
Desde la década de 1960, algunos países han realizado cultivos de tejidos del género Dioscorea y otras familias relacionadas para estudiar la formación de diosgenina y explorar su mecanismo biosintético. Se sabe que 7 especies de plantas Dioscorea pueden obtener diosgenina u otros compuestos esteroides mediante cultivo de tejidos. Entre ellas, ¿Diosgenina? ¿Deltoides? Wal1. El contenido de diosgenina obtenida del cultivo de tejidos es de 0,3 ~ 2,5, además de rotenona, glicirricina, nicotina, etc. Por ejemplo, se puede producir 2,9 (peso seco) de nicotina mediante cultivo en suspensión de células de la punta de la raíz del tabaco.
Agregar hormonas de crecimiento, vitaminas u otros químicos a los medios de cultivo basales de uso común a veces puede aumentar los metabolitos. Por ejemplo, cuando se realiza un cultivo de tejido de Datura, agregar 0,1 de tirosina al medio de cultivo puede aumentar la producción de atropina en más de 7 veces. Cuando se cultiva un cultivo de tejido de Rutaceae, agregar 4-hidroxi-2-quinina al medio de cultivo puede promover la síntesis y acumulación de alcaloides. En ambos casos, los aditivos se consideran precursores biosintéticos. Otro ejemplo es la suplementación de 1my/1 de cinetina en la última etapa de crecimiento del cultivo de callos, y el contenido de escopolamina puede alcanzar 0,495, que es mucho mayor que el de la planta original.
Además de la composición del medio de cultivo, los factores ambientales también afectan a la producción de sustancias secundarias. Por ejemplo, aunque el cultivo de tejidos de apio prolifera en la oscuridad, no forma flavonoides, pero la apigenina se puede detectar bajo la luz. Aunque la historia de la aplicación del cultivo de tejidos en medicina no es larga, se ha desarrollado rápidamente. Tiene las siguientes ventajas:
1. Utilice el cultivo de tejidos para reemplazar el cultivo de plantas original para obtener los ingredientes activos necesarios, lograr un alto rendimiento y un bajo costo, y ahorrar tierra.
2. No sólo se puede utilizar para producir biomasa secundaria, sino que también se puede utilizar para transformación biológica. Por ejemplo, en el cultivo de tejidos de tabaco, la tebaína se desmetila para producir morfina.
3. Se descubrieron nuevos compuestos a partir de análisis cualitativos de cultivos de tejidos. Por ejemplo, en cultivos de tejidos del género Rutaceae, se sintetiza y acumula rutina, un compuesto que no se detecta en la planta original ni en otras plantas. Por tanto, el cultivo de tejidos se convertirá en una fuente de nuevos compuestos bioactivos.
4. En general, el cultivo de tejidos es heterótrofo, pero también existen líneas celulares autótrofas que tienen la capacidad de realizar la fotosíntesis y no dependen del suministro externo de azúcar. Esta característica hará que la tecnología de cultivo celular sea superior a las plantas enteras y más económica.
En la actualidad, unidades relevantes en mi país han industrializado con éxito hongos como el cornezuelo, Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus, etc., y también se está estudiando la aplicación del cultivo de tejidos vegetales superiores en la industrialización.
En resumen, las perspectivas de aplicación del cultivo de tejidos vegetales en la medicina herbaria china son ilimitadas. No sólo favorece la exploración y aclaración de una serie de cuestiones teóricas como la fisiología, la genética y la biosíntesis de sus componentes. plantas medicinales, pero también los problemas de producción una vez industrializados. Si se resuelven, supondrá una enorme contribución a la prevención y el tratamiento de enfermedades.