La historia de la investigación de Yamanaka Shinya
Este cirujano ortopédico fallido fue finalmente reclutado por Thomas Innerarity del Instituto Gladstone de California (Figura 1). El laboratorio de Thomas estudia la regulación de los lípidos en sangre, lo que de alguna manera está relacionado con el trabajo de Shinya durante su período. El nuevo tema de Shinya es estudiar la proteína de edición ApoBEC1 del ARNm de ApoB.
La ApoB es el componente principal de las lipoproteínas de baja densidad. El ARNm de ApoB puede ser desaminado mediante la enzima de edición ApoBEC1 para terminar prematuramente la traducción, formando dos proteínas de diferentes tamaños: ApoB100 de longitud completa y ApoB48 de aproximadamente media longitud. ApoB48 editado se elimina rápidamente del plasma. Thomas predice que si ApoBEC1 se sobreexpresa en el hígado, los lípidos en sangre pueden reducirse; si este modelo es factible, la terapia génica puede ayudar a algunos pacientes obesos a reducir los lípidos en sangre en el futuro;
Shinya trabajó diligentemente los siete días de la semana y pasó seis meses fabricando ratones transgénicos. Una mañana, el técnico que lo ayudaba a mantener a los ratones le dijo: Shinya, muchas de tus ratas están preñadas, pero los ratones son machos. Shinya dice que no estás bromeando. Cuando fue a la sala de las ratas, descubrió que muchas ratas macho parecían preñadas. Mató a algunos de ellos y descubrió que los ratones tenían cáncer de hígado y que sus hígados y vientres estaban agrandados.
Después de la sobreexpresión de ApoBEC1, las lipoproteínas de baja densidad disminuyeron, pero las lipoproteínas de alta densidad aumentaron. Al mismo tiempo, también se diagnosticó cáncer de hígado. Esta transacción no vale la pena. Shinya resumió las lecciones aprendidas en una conferencia: primero, la ciencia es impredecible; segundo, no pruebe nuevos tratamientos genéticos en pacientes; tercero, y quizás lo más importante, no crea en la hipótesis de su mentor;
Thomas quedó decepcionado porque los resultados no cumplieron con las expectativas, pero este resultado inesperado despertó la curiosidad de Shinya: ¿Cuál es el mecanismo que hace que los ratones desarrollen tumores? Afortunadamente, Thomas tuvo la mente lo suficientemente abierta y permitió que Shinya se desviara de la dirección principal del laboratorio y continuara explorando el mecanismo cancerígeno de ApoBEC1. Es posible que la sobreexpresión de ApoBEC1 también pueda editar otros ARNm además de ApoB. Encontrar estos ARNm puede explicar por qué ApoBEC1 puede causar cáncer.
Dado que se sabe que ApoBEC1 necesita reconocer la secuencia específica del ARNm del sustrato para poder editarlo, Shinya diseñó la amplificación del cebador en consecuencia y encontró un nuevo sustrato de ApoBEC1: Nat1, un gen que inhibe la traducción de proteínas. Después de la sobreexpresión de ApoBEC1, la proteína Nat1 desaparece. Lógicamente, si la edición de Nat1 es una molécula importante que hace que ApoBEC1 cause cáncer, entonces los ratones knockout para Nat1 también desarrollarían cáncer.
La desactivación genética es más compleja que el transgén y requiere la integración in situ del plásmido construido en células madre embrionarias cultivadas in vitro. ¿No es la tecnología de eliminación de genes la tecnología que Shinya soñaba con aprender durante su doctorado? Entonces Shinya encontró a Robert Farese, un experto en eliminación de genes del instituto que era profesor asistente en ese momento. Aprendió cada detalle de esta tecnología de su asistente Heather Myers y obtuvo con éxito ratones heterocigotos con eliminación de Nat1. Heather Myers es amiga de toda la vida de Shinya; después de que Shinya descubriera iPS, también expresó públicamente su gratitud a Heather Myers, porque fue ella quien le dijo a Shinya que las células madre embrionarias no solo son un medio para inutilizar ratones, sino que también pueden ser muy interesantes en ellos mismos.
Mientras Shinya seguía preguntando con entusiasmo sobre la función de Nat1, su esposa lo dejó y regresó a Japón con su hija. Medio año después, decidió interrumpir su investigación, se llevó tres preciosos ratones heterocigotos Nat1 y regresó a China con su familia.
La etapa Caterpillar en Osaka-Nat1
Con los cuatro artículos de primer autor de alta calidad que publicó durante su período postdoctoral, Shinya encontró un puesto como profesor asistente en su alma mater. , Universidad de la ciudad de Osaka, en 1996, continúa su investigación Nat1.
Una vez más, se desvió de la predicción: después de la desactivación de Nat1, los ratones homocigotos murieron temprano en el desarrollo embrionario y fue imposible observar si los ratones adultos desarrollaron tumores.
La investigación adicional de Shinya encontró que las células madre embrionarias con Nat1 desactivado no podían diferenciarse como las células madre normales in vitro. En ese momento recordó las palabras de Heather Myers: Las células madre embrionarias no son sólo una herramienta para la investigación, sino que también pueden ser objetos de investigación muy interesantes por derecho propio. Su atención comenzó a desplazarse hacia las células madre embrionarias.
En los primeros años después de regresar a Osaka, Shinya solo pudo obtener una pequeña cantidad de financiación para la investigación porque apenas estaba comenzando. Tenía que criar cientos de ratones él solo y su vida era muy difícil. . Al mismo tiempo, la investigación básica en la Facultad de Medicina de la Universidad de la ciudad de Osaka es muy débil. Las personas que la rodean no comprenden la importancia de la investigación de Shinya sobre la función de Nat1 en las células madre embrionarias y siempre persuaden a Shinya para que realice investigaciones más cercanas a la medicina. aspectos clínicos. El trabajo de investigación de Nat1 fue rechazado después de ser enviado a la revista. Debido a todo tipo de presiones y frustraciones, Shinya contrajo una enfermedad llamada PAD (Post America Depression, broma autoinventada) y casi abandonó la investigación científica y regresó a China para convertirse en cirujano ortopédico.
En su punto más bajo, dos cosas lo salvaron de PAD. Uno de ellos es James Thomson (el mentor de Yu Junying, que anunció la creación de iPS humanos casi al mismo tiempo que Shinya en 2007, anunció que había recolectado y establecido líneas de células madre embrionarias a partir de blastocistos humanos: estas células madre eran). cultivado in vitro durante varios meses, posteriormente también puede diferenciarse en células de diferentes capas germinales, como células epiteliales intestinales, condrocitos, células neuroepiteliales, etc. Esto animó mucho a Shinya y se convenció cada vez más de que la investigación con células madre embrionarias era significativa y algún día se utilizaría clínicamente. La segunda cosa fue que la Escuela de Graduados en Ciencia y Tecnología Avanzada de Nara, que tenía mejores condiciones, se enamoró de su experiencia, lo reclutó para establecer una instalación para ratones con genes knockout y le ofreció el puesto de profesor asociado.
Etapa de pupa de Nara-Fbx15
Después de mudar varias capas de piel después de todo el arduo trabajo, Shinya finalmente tiene su propio laboratorio independiente. Es genial poder reclutar ayudantes por primera vez. Pero el problema vuelve a surgir: la fuente de estudiantes de posgrado es limitada, y los estudiantes tenderán a elegir laboratorios con calificaciones más antiguas y mejores condiciones, en lugar de laboratorios que recién están comenzando y que no vienen; Para atraer estudiantes a su laboratorio, Shinya pensó mucho durante un tiempo y propuso un plan ambicioso, afirmando que el objetivo a largo plazo del laboratorio es estudiar cómo transformar células adultas terminalmente diferenciadas en células madre pluripotentes.
La corriente principal de la comunidad científica en ese momento era estudiar cómo diferenciar las células madre pluripotentes embrionarias en células de diversos tejidos, con la esperanza de utilizar estas células funcionales diferenciadas para reemplazar las células de tejido dañadas o enfermas. Shinya cree que su laboratorio no tiene la fuerza para competir con estos grandes nombres, por lo que es mejor hacer lo contrario y estudiar cómo revertir las células diferenciadas en células madre pluripotentes.
La opinión predominante en la comunidad científica en ese momento era que la diferenciación celular durante el desarrollo embrionario de los mamíferos era unidireccional, como si el tiempo fuera irreversible. Esta visión no está exenta de defectos. Por ejemplo, los tejidos vegetales son pluripotentes. Los tallos de algunas plantas insertados en el suelo volverán a crecer como planta. Es decir, las células madre diferenciadas pueden cambiar su destino y diferenciarse en nuevas células de raíz, tallo y hoja. . Ya en 1962, el año en que nació Shinya, Sir John Gurdon del Reino Unido (que compartió el Premio Nobel con Shinya) informó de su sorprendente descubrimiento: al trasplantar núcleos de células intestinales de renacuajo en huevos de rana enucleados, nuevas células pueden convertirse en renacuajos. Si las células heterocigotas se desarrollan hasta la etapa de blastocisto y los núcleos de la etapa de blastocisto se utilizan para el trasplante nuclear, se pueden desarrollar ranas adultas que puedan reproducirse. Además, para convencer a la gente de que aceptaran que los núcleos celulares terminalmente diferenciados también tienen pluripotencia, cultivó células de diferentes tejidos de ranas adultas in vitro y descubrió que después del trasplante nuclear, células híbridas de diferentes fuentes pueden desarrollarse hasta la etapa de renacuajo. En 1997, basándose en el mismo principio, Ian Wilmut y Keith Campbell trasplantaron núcleos de células mamarias de oveja en óvulos de oveja enucleados y crearon con éxito la oveja clonada Dolly. En 2001, los científicos descubrieron que los núcleos de los timocitos se reprogramaban en gran medida mediante fusión con células madre.
El primer paso del plan de Shinya es encontrar tantos factores como sea posible que sean similares a Nat1 y estén involucrados en el mantenimiento de la función de las células madre (los factores de mantenimiento significan que estos factores son necesarios para que las células madre embrionarias mantengan la pluripotencia cultivo in vitro). Especuló audazmente que si estos factores de mantenimiento se sobreexpresan, las células terminalmente diferenciadas pueden volver a convertirse en células madre pluripotentes. Una vez exitosas, las células madre pluripotentes inducidas tendrán ventajas que las células madre embrionarias no tienen: no sólo pueden sortear los problemas éticos causados por las células madre embrionarias, sino que cuando las propias células madre inducidas del paciente se modifican y se reimplantan en el paciente, al ser células propias, no habrá problema de rechazo inmunológico.
Inspirado por esta gran perspectiva, Shinya "engañó" a tres estudiantes para que se unieran a su laboratorio. Pronto identificaron una serie de genes expresados específicamente en células madre embrionarias. Uno de estos genes es Fbx15. El estudiante de Shinya, Yoshimi Tokuzawa, descubrió que además de expresarse específicamente en células madre embrionarias, Fbx15 también puede regularse directamente por otros dos factores de mantenimiento de células madre embrionarias, Oct3/4 y Sox2. Shinya le dijo a Yoshimi: Fbx15 debería participar en el mantenimiento de la pluripotencia de las células madre y el desarrollo embrionario. Supongo que no se pueden conseguir ratones homocigotos desactivados para Fbx15. Yoshimi construyó plásmidos para crear ratones knockout, reemplazando el gen Fbx15 en el cromosoma con el gen neo que resiste el fármaco G418 mediante recombinación homóloga.
La vida compleja volvió a engañar a Shinya: los ratones homocigotos knockout Fbx15 vivían sanos y no tenían un fenotipo evidente. Shinya volvió a desafiar a sus estudiantes: Bueno, es posible que Fbx15 no sea necesario para el desarrollo embrionario de ratón, pero debería serlo para el mantenimiento de células madre embrionarias in vitro. Apuesto a que no se puede eliminar completamente este gen en las células madre embrionarias. El diligente Yoshimi utilizó una concentración más alta de G418 para detectar cepas homocigotas knockout de células madre, que todavía estaban vivas y bien y no tenían fenotipo. Más tarde, Shinya bromeó al recordar: Los ratones estaban muy felices y las células también estaban muy felices. El único que no estaba feliz era el pobre estudiante Yoshimi.
Pero los ratones knockout que requirieron tanto esfuerzo para crearlos no pueden olvidarse. Shinya una vez más usó su cerebro para reciclar desechos. Descubrió que debido a que Fbx15 solo se expresa en células madre embrionarias, el gen de resistencia a los medicamentos neo controlado por el promotor Fbx15 no se expresa en fibroblastos adultos, por lo que las células son sensibles al medicamento G418; sin embargo, las células madre embrionarias obtenidas de ratones knockout sí pueden; reaccionar en concentraciones muy altas cultivadas en G418. Si se pueden inducir fibroblastos terminalmente diferenciados en células madre embrionarias, se volverán resistentes al G418. Incluso si los fibroblastos adquieren sólo algunas de las propiedades de las células madre embrionarias, aún deberían ser resistentes a bajas concentraciones de G418 (Figura 2). ¡Los ratones knockout para Fbx15 en realidad proporcionan un buen sistema para detectar células madre inducidas! Gracias a su destacado trabajo en la identificación de los factores de mantenimiento de las células madre embrionarias, Shinya encontró un nuevo puesto en la más prestigiosa Universidad de Kyoto en 2004. Además del sistema de detección de ratones knockout Fbx15, Shinya también acumuló 24 factores de mantenimiento que identificó e informó en la literatura. Shinya está ansioso por intentarlo, ¡está listo para salir del caparazón y batir sus alas para convertirse en una mariposa!
Otro alumno de Shinya, Kazutoshi Takahashi, ha publicado anteriormente un artículo en Nature sobre la carcinogenicidad de las células madre. Shinya decidió dejarle abordar el tema más atrevido: la diferenciación inversa de las células somáticas, porque sabía que con un artículo de Nature como garantía, aunque no se consiguiera nada en los próximos años, sus alumnos podrían soportarlo.
Incluso con un buen sistema de detección, este tema parecía muy arriesgado o incluso inviable al principio. La gente de esa época generalmente creía que las células adultas habían perdido su pluripotencia. Quizás las propias células adultas eran irreversibles y serían inútiles, hicieras lo que hicieras. Incluso si la inversión del destino nuclear de las células adultas se logra mediante la tecnología de nucleación, se trata sólo del núcleo, no de la célula completa. Los cromosomas de las células embrionarias y de las células adultas son iguales y el núcleo es totipotente, lo cual es comprensible. Además, para lograr la reversión del núcleo, es necesario transferirlo al óvulo, de modo que el citoplasma del óvulo pueda ayudarlo a reprogramarse, y hay innumerables proteínas en el citoplasma del óvulo. Para lograr revertir el destino de toda la célula, es necesario reorganizar todas las proteínas del citoplasma.
Incluso si las células pudieran reprogramarse, muchas proteínas deberían participar simultáneamente. Shinya sólo tenía 24 puntos en sus manos en aquel entonces. Puede que falten cientos o miles de otros factores, y la reprogramación es imposible sin siquiera uno de ellos. Utilizar estos 24 factores para lograr la reprogramación celular de forma caprichosa es lógicamente imposible según el conocimiento existente.
A Kazutoshi, un joven estúpido, no le importó esto. Infectó los fibroblastos uno por uno con virus que sobreexpresaban estos factores. Por supuesto, no se descartaron células resistentes al G418. Shinya sabía cómo mantener motivados a los estudiantes. Fingió estar tranquilo y dijo: "Mira, esto demuestra que nuestro sistema de detección es muy bueno. No hay falsos positivos".
Después de intentarlo en vano, Kazutoshi propuso audazmente que quería mezclar 24 virus para infectar células al mismo tiempo. Shinya piensa que es una idea estúpida: nadie ha hecho esto nunca, compañero de clase, pero un caballo muerto es tratado como un caballo vivo. Si no estás cansado, adelante, inténtalo.
Después de esperar unos días, ocurrió un milagro. ¡Había más de una docena de clones de células anti-G418 que aparecían escasamente en la placa de cultivo! Se hizo un descubrimiento que hizo época.
Después del gran avance del experimento clave, todo lo demás encajó en su lugar. Kazutoshi eliminó un virus a la vez y mezcló los 23 virus restantes para infectar células adultas y ver cuántos clones se podían cultivar para identificar qué factores eran necesarios para inducir células madre. Finalmente, identificó cuatro factores estrella: Oct3/4, Sox2, c-Myc y Klf4. ¡La sobreexpresión de estos cuatro factores en los fibroblastos es suficiente para convertirlos en células madre pluripotentes!
¿Los clones celulares resistentes a G418 son necesariamente células madre pluripotentes? A través de una serie de indicadores, como perfiles de expresión génica, potencial de diferenciación, etc., comprobaron que estas células se parecen en gran medida a las células madre embrionarias.
En 2006, Shinya informó sobre la inducción de células madre en ratones, causando sensación en la comunidad científica [13]; en 2007, también logró la reversión del destino celular en células humanas, lo que causó revuelo en la comunidad científica; comunidad [14]. Mirando hacia atrás, ¿cómo pudo Shinya tener tanta suerte de triunfar a pesar de todas las imposibilidades? A través de más investigaciones, sabemos que el mantenimiento de las características de las células madre está coordinado por una red genética. Al regular positivamente ciertos genes clave, esta red puede reconstruirse y revertirse el destino de la célula. Los cuatro factores finalmente identificados por Yamanaka Shinya no son necesarios; , y se puede lograr el mismo propósito combinando factores distintos de los 24 factores. Esto es como una gran red. Mientras puedas sostener algunos de los puntos de apoyo, puedes sostener toda la red.
El descubrimiento de las iPS tiene una importancia inusual. En primer lugar, ha actualizado los conceptos de la gente. A partir de ahora, la gente ya no cree que el destino de las células sea irreversible. No sólo se puede revertir, sino que las células pueden lograr una transdiferenciación entre diferentes tejidos. En segundo lugar, las células iPS evitan el dilema ético de las células madre embrionarias. Muchos laboratorios pueden repetir este sencillo experimento para obtener células iPS y realizar investigaciones sobre células madre pluripotentes. En tercer lugar, las células iPS tienen muchas ventajas que las células madre embrionarias no tienen: si las propias células iPS del paciente se manipulan in vitro y se reimplantan en el paciente, la respuesta inmune se reducirá considerablemente si las células somáticas del paciente se invierten en ips; células y diferenciadas in vitro Al observar los problemas que surgen durante este proceso, es posible simular hasta cierto punto la aparición de la enfermedad en una placa de Petri después de que las iPS específicas de la enfermedad se expandan y diferencien in vitro; para detectar medicamentos para tratar la enfermedad, o para probar la toxicidad de los medicamentos.
Pero esto es sólo un nuevo comienzo. Las ciencias de la vida son tan complejas e impredecibles que todavía existen muchas dificultades para convertir estas visiones en realidad y hacer que las iPS realmente beneficien a la humanidad. Shinya Yamanka, el niño mimado de la ciencia, se embarcó sin miedo en un nuevo viaje con el ideal original de ayudar a más pacientes.