¿Cómo se analizan los resultados de la PCR cuantitativa en tiempo real?
2. Generalmente es una cantidad relativa, por lo que se calcula mediante el método △△CT.
3. El ejemplo es el siguiente: el valor CT del gen A en el grupo de control es 20 y el valor CT de la referencia interna (como la β-actina) es 15. El valor de CT del gen A en el grupo experimental fue 18 y el valor de CT de la referencia interna fue 14.
4. Primero calcule el tamaño de la muestra: δCT = 15-14 = 1. La potencia de 2 elevada a 1 es 2. Es decir, el tamaño de la muestra del grupo experimental fue el doble que el del grupo de control. Gen A: δCT = 20-18 = 2. El cuadrado de 2 es 4. En otras palabras, la cantidad de gen A en el grupo experimental fue 4 veces mayor que la del grupo de control. Pero como la cantidad de la muestra es 2 veces, el número de 4 dígitos es 2 = 2 y la cantidad relativa final es 2 veces.
5. Varios puntos a tener en cuenta: Se debe determinar la especificidad de la amplificación. Sólo se puede restar el valor CT del mismo objetivo (la eficiencia de amplificación puede ser diferente). Una determinada potencia de 2 es solo un valor teórico y la eficiencia de amplificación real es inferior a 2. Es mejor no utilizar Cybergreen.
Datos ampliados:
Principio de PCR:
1 El principio básico de la tecnología de PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN, y su especificidad depende de la secuencia diana. Cebadores oligonucleotídicos con extremos complementarios.
2. La PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización-recocido-extensión:
(1) Desnaturalización del ADN molde: calentar el ADN molde a aproximadamente 93 °C durante un tiempo determinado. Durante un período de tiempo, el ADN bicatenario del ADN molde o el ADN bicatenario formado por amplificación por PCR se disocia para combinarse con el cebador y prepararse para la siguiente ronda de reacción;
(2 ) Recocido del ADN molde y el cebador (Renaturalización): después de calentar y desnaturalizar el ADN molde en una sola hebra, la temperatura se reduce a aproximadamente 55 °C y el cebador se empareja con la secuencia complementaria del ADN molde único. strand;
③Extensión del cebador: utilizando el acoplamiento plantilla-cebador de ADN a 72 °C, utilizando dNTP como materia prima de reacción y la secuencia objetivo como plantilla, de acuerdo con el principio de emparejamiento de bases complementarias y semiconservador. replicación, bajo la acción de la ADN polimerasa (como la TaqDNA polimerasa), se sintetiza una cadena de ADN complementaria a la plantilla de nuevas hebras de replicación semiconservadoras. Se necesitan de 2 a 4 minutos para completar un ciclo y el gen objetivo que se va a amplificar se puede amplificar un millón de veces en 2 a 3 horas.
Enciclopedia Baidu - Reacción PCR