¿Cuál no es una medida de los laboratorios PCR para evitar falsos positivos?

Para los laboratorios que realizan PCR en grandes cantidades, los falsos positivos provocados por la contaminación de las pipetas no son una situación infrecuente.

La PCR, especialmente la tecnología rt-PCR, se ha convertido gradualmente en un método estándar para el diagnóstico de enfermedades. Por ejemplo, en la reciente epidemia de COVID-19, los resultados de la RT-PCR son uno de los criterios de diagnóstico. En el caso de las pruebas de PCR, no se pueden ignorar los resultados falsos positivos causados ​​por la contaminación del equipo de laboratorio. Especialmente cuando el volumen de muestra es extremadamente grande y el instrumento de PCR está funcionando continuamente, la sala de pruebas suele estar en un ambiente cerrado, lleno de aerosoles y el instrumento se contamina fácilmente. Las pipetas suelen ser los instrumentos más cercanos a la muestra y se utilizan con mayor frecuencia. Es muy fácil que se contaminen ya sea durante el proceso de aspiración o en el entorno operativo. Las pipetas contaminadas pueden introducir muestras o ácidos nucleicos contaminados en muestras posteriores o sistemas de reacción de PCR, lo que genera señales detectadas y resultados falsos positivos.

Tomamos la pipeta de la marca alemana transferpette como ejemplo para presentar cómo limpiar la pipeta para reducir el riesgo de falsos positivos causados ​​por la contaminación de la pipeta. Las pipetas Transferpette de la marca alemana tienen las ventajas de un fácil desmontaje y mantenimiento, fácil reemplazo de accesorios y tecnología de calibración sencilla, que permite la calibración de pipetas sin herramientas. Y la pipeta de la transferpette se puede esterilizar en un autoclave de 121 oc, que es especialmente adecuado para experimentos de PCR.

La parte donde la contaminación de la pipeta es probable que cause riesgos de falsos positivos en los experimentos de PCR es principalmente la mitad inferior. La contaminación se divide en dos tipos: 1. Contaminación fuera del fuselaje. Generalmente, debido a la centrifugación, agitación o calentamiento por PCR, los aerosoles se difunden en el entorno experimental y contaminan el exterior del fuselaje. O si el exterior del fuselaje toca accidentalmente la pared interior del tubo de centrífuga durante el funcionamiento, la pipeta puede estar contaminada. En experimentos posteriores, es posible que toque accidentalmente tubos de muestra, tubos de centrífuga, etc., lo que puede provocar el riesgo de falsos positivos. 2. Aspire hacia atrás cuando aspire líquido o contaminación en aerosol del líquido aspirado. Si no se utiliza una punta con filtro al manipular muestras y se produce un mal funcionamiento, lo que hace que la muestra sea succionada nuevamente hacia la pipeta y no se limpie a tiempo, puede contaminar muestras posteriores y causar un riesgo de falso positivo. La contaminación por aerosoles durante el pipeteo no se puede subestimar. Tomando como ejemplo una pipeta de 20 μl, a una temperatura ambiente de 20 oc y una humedad relativa de aproximadamente el 60% rh, la tasa de evaporación durante el pipeteo puede alcanzar 0,046 μl/s, lo que equivale a 0,046 μl/s. Evaporar el 0,23% del volumen total de pipeteo por segundo. En este caso, si no se utiliza una punta con filtro, el líquido evaporado inevitablemente transportará la muestra y entrará en la mitad inferior de la pipeta, y se soplará en muestras posteriores durante operaciones posteriores, provocando el riesgo de falsos positivos.

Si se produce una retrosucción o se toca accidentalmente la pared interior del tubo de muestra, detenga la operación inmediatamente y límpielo. La contaminación por aerosoles se puede reducir mediante una limpieza regular.

A continuación se describe cómo desmontar y limpiar la pipeta Transferpette de la marca alemana:

El primer paso es limpiar la superficie exterior de la pipeta con etanol al 75% o alcohol isopropílico. Limpieza y desinfección básica

El segundo paso es retirar la mitad inferior del brazo girándolo y retirar el pistón (i), el anillo de sellado del resorte (ii) y el manguito cónico del cabezal de succión (iii). girándolo y el manguito de punta emergente (iv).

El tercer paso consiste en remojar todas las piezas en etanol al 75% o alcohol isopropílico durante 30 minutos. Retirar y enjuagar con agua desionizada.

El cuarto paso es colocar todas las piezas en un limpiador ultrasónico que contenga detergente para limpieza ultrasónica durante 10 minutos, sacarlas y enjuagarlas con agua desionizada.

En el quinto paso, dependiendo de la gravedad de la contaminación del ácido nucleico, los accesorios como el manguito del cono de la punta, el pistón, etc. se pueden remojar en tampón de clorhidrato de glicina (pH aproximadamente 2,0) durante la noche. Después de sacarlo, enjuáguelo con agua desionizada. Método de preparación del tampón de glicina y ácido clorhídrico: tomar 30,6 g de nacl, 39,2 g de glicina, agregar agua desionizada para llevar el volumen a 523 ml, agregar 477 ml de hcl 1 n y preparar un tampón 10x. Diluir 1:10 al usarlo. Se deben reemplazar los sellos muy contaminados.

Paso 6: Después de que las piezas estén secas, aplique aceite de silicona original al pistón y al anillo de sellado.

En el séptimo paso, instale la pipeta girándola en la dirección opuesta al segundo paso.

Para pipetas con contaminación infecciosa, por razones de seguridad del personal, se debe usar equipo de protección como guantes, máscaras, gafas, etc. durante toda la operación. La tapa debe estar cerrada durante la ecografía y la pipeta debe estar cerrada. debe retirarse después de la limpieza ultrasónica. Esterilizar el recipiente de líquido en un recipiente esterilizador a 121 oc durante 20 minutos y luego realizar la limpieza posterior. A veces, para reducir el riesgo de infección, se realiza la esterilización a alta temperatura como primer paso. Preste atención a la condensación de suciedad dentro y fuera del cuerpo de la pipeta. La esterilización a alta temperatura sin limpiar puede no lograr una desinfección completa y dañar la pipeta. pipeta. recipiente de líquido.

Por último, hay que destacar que se recomienda utilizar puntas con filtro esterilizadas preinstaladas de marca al realizar experimentos de detección por PCR. Puede evitar el riesgo de contaminación introducida al instalar manualmente puntas de pipeta y evitar falsos positivos causados ​​por la inhalación de aerosoles al manipular muestras.