Estudio de caso del informe experimental del servicio de purificación y expresión de proteínas de células de mamíferos
1. ¿Diseño experimental?
Analizamos la secuencia del gen objetivo proporcionada por el cliente. Toda la secuencia de proteínas es hidrófila y no tiene una secuencia de péptido señal, por lo que nuestras ideas de diseño son las siguientes:
1.1. la secuencia genética del cliente La secuencia de proteína traducida se utilizó como plantilla fuente y se obtuvo un conjunto de secuencias genéticas más adecuadas para la línea celular HEK293 mediante la optimización de codones.
1.2. Se recomienda que los clientes utilicen el vector independiente pAZ-V5 de Zhongding Biotech para experimentos. La secuencia del péptido señal V5 del vector facilita la secreción y expresión de proteínas fuera de la célula. Para mantener la actividad N-terminal de la proteína, agregamos 6XHis-Tag al extremo C para facilitar la detección y purificación por afinidad de la proteína recombinante.
Basándose en las ideas de diseño anteriores, se construyó el plásmido de expresión pAZ-V5 mediante síntesis genética. Después de la secuenciación y la digestión con enzimas de restricción, se seleccionan plásmidos libres de endotoxinas. Transfecte 200 ml de células HEK293, detecte la expresión de proteínas mediante transferencia Western, confirme la expresión de proteínas y luego la purificación por afinidad con resina de Ni para obtener más del 80% de la proteína objetivo.
II.Reactivos y consumibles
Nombre de la empresa Nombre de la empresa
DMEM alto en azúcar, DMEM bajo en azúcar, suero fetal bovino, tripsina, opti SFM, reactivo de transfección Invitrogen (Gibco) kit de extracción de plásmido libre de endotoxinas, reactivo de detección de endotoxinas LAL, reactivos químicos básicos, agarosa Sigma de bajo punto de fusión.
Kit de extracción Kit de PCR Axygen IO-RAD Company
Placa de seis pocillos, matraz de cultivo celular, tubo de centrífuga, tubo de reacción de PCR Fisher Company
Kit de purificación de gel de ADN , kit de extracción de plásmido AXYGEN Company agarosa Shanghai Gene Company.
Otros reactivos de Neutral Red Blue Sky Biotechnology Co., Ltd. son analíticamente puros y se fabrican en China.
II.Principales instrumentos experimentales
Nombre del instrumento Empresa Nombre del instrumento Empresa Nombre del instrumento Empresa
Centrífuga refrigerada de escritorio de alta velocidad Allegra 21R Centrífuga de escritorio de alta velocidad de la empresa BECKMAN Alemania SORVAL El sistema de electroforesis de placa vertical Mini Protean II, el sistema de imágenes Gel Doc2000 y el sistema de electroforesis horizontal de la empresa son empresas estadounidenses BIO-RAD.
Amplificador de genes PTC-200, medidor de pH 320-S de MJ Research Company en Estados Unidos, balanza electrónica AR5120 de Mettler-Toledo Company en Estados Unidos y AHOM Company en Estados Unidos.
Baño de agua a temperatura constante MultiTemp III, emisor ultravioleta Hofer μV-25, máquina de hielo en copos de nieve estadounidense Amersham Pharmacia, trituradora de células ultrasónica japonesa Sanyo JY92-2D, Instituto de Investigación Xinzhi Keqi de China.
Detector de ácido nucleico de proteínas Universidad de Nanjing Fábrica de instrumentos científicos Puyang NANODROP2000 Compañía termoeléctrica Banco de trabajo limpio China Sujing Group
Cuarto, análisis de las propiedades de las proteínas
4.1 Clientes El gen original secuencia proporcionada
gtggggtgct * * * * * nnnnnnnnnnnnnnnnnn-Contenido de investigación relacionado con el cliente, no se mostrará-NNNNNNNNNNNNNNNNNN nnn nnn * * * * * * CTTCTCCCTT.
La secuencia de proteínas codificada por 4.2 es la siguiente (peso molecular teórico 41,18 KD, punto isoeléctrico teórico PI6,73).
GCSVDFSK * * * * * nnnnnnnnnnnnnnn-nnnnn nnn nnn nnn nnn nnn * * * * * EtiquetaSTDHMDHFSL.
4.3 El análisis de secuencia de codones raros se muestra en la siguiente figura (rojo: la frecuencia de uso es inferior al 10 %, gris: la frecuencia de uso es inferior al 20 %, verde son codones de frecuencia normal).
4.4 Análisis transmembrana e hidrofilia de secuencias de proteínas
4.5 Predicción de péptidos señal
En resumen:
1. El peso es 41 KD, que está dentro del rango de peso molecular normal y es adecuado para la expresión.
2. Según el análisis de la frecuencia de uso de codones genéticos, si se utilizan 293 células como huésped de expresión, se obtienen codones X con una frecuencia inferior al 20 % y codones X con una frecuencia inferior al 10 %. se utilizan en la secuencia del gen, después de la optimización. El gen diana se obtiene mediante síntesis de genes.
3. Mediante el análisis de la estructura transmembrana y la hidrofobicidad de la proteína, la proteína general es hidrófila, pero la proteína después de 473AA tiene una estructura transmembrana típica, se recomienda eliminarla antes de expresarla para mejorar. la tasa de éxito.
4. La proteína diana en sí no tiene un péptido señal. La adición del péptido señal GP67 facilita la secreción y expresión de la proteína. Para facilitar la purificación, puede considerar agregar una etiqueta His al extremo C.
Métodos y resultados experimentales de verbo (abreviatura de verbo)
5.1 Construcción del plásmido de expresión pAZ-V5
Mediante PAS (síntesis de precisión basada en PCR) basado Métodos El gen diana se sintetizó y se conectó entre Afl II y Xba I del vector pAZ-V5 mediante digestión enzimática doble. El plásmido recombinante obtenido se transfirió a cepas de clonación TOP10 y se seleccionaron clones positivos para la secuenciación. El empalme de los resultados de la secuenciación se muestra a continuación. El área de una sola línea de puntos es la región del gen objetivo. El área violeta es el sitio de restricción, el área amarilla es el péptido señal v5 y el área verde es la etiqueta 6XHis.
Este es un buen ejemplo, se puede decir que es un buen ejemplo
5.2 Utilice el software Chromas para ver el archivo de pico de secuenciación. Los ejemplos de interceptación de secuencias parciales son los siguientes:
5.3 El diagrama esquemático del vector pAZ-V5 es el siguiente:
Optimización de las condiciones de expresión
Para obtener más descripciones de servicios, consulte el sitio web oficial de Zhongding Biotecnología.