¿Cómo escribir una tesis de graduación sobre diagnóstico molecular de cambios en la metilación del promotor de genes?

La metilación del ADN es una modificación epigenética. Es una reacción en la que la ADN metiltransferasa (DNMT) utiliza S-adenosilmetionina como donante de metilo para convertir la citosina en 5-metilcitosina (mC). En el ADN eucariótico, la 5-metilcitosina es la única base químicamente modificada. Los dinucleótidos CG son los sitios de metilación más importantes. Está distribuido de manera desigual en el genoma, con regiones hipermetiladas, hipometiladas y no metiladas. En los mamíferos, mC representa aproximadamente 2-7 del c total. En términos generales, la metilación del ADN inhibe la expresión génica. La metilación del ADN juega un papel importante en el mantenimiento de la estructura cromosómica, la inactivación del cromosoma X, la impresión genética y el desarrollo de tumores.

La distribución de los dinucleótidos CpG en el genoma humano es muy desigual, pero en algunos segmentos del genoma, CpG permanece en la probabilidad normal o por encima de ella. Estos segmentos se denominan islas CpG. Las islas CpG están ubicadas principalmente en las regiones promotoras y del primer exón de los genes. Aproximadamente el 60% de los promotores de genes contienen islas CpG. El estudio de la metilación de CpG juega un papel muy importante en la investigación de tumores. La metilación de la citosina en la región promotora y las islas CpG cercanas puede regular la expresión génica a nivel transcripcional, silenciando así el gen correspondiente, y la desmetilación puede restaurar su expresión. En condiciones fisiológicas, la metilación del ADN participa en el control de la expresión temporal y espacial de los genes. La hipometilación de las células tumorales en todo el genoma es una característica importante cuando se desarrollan tumores. En comparación con las células normales, el grado de metilación del genoma de las células tumorales es solo de 20 a 60, acompañado de hipermetilación de genes locales, incluidos genes supresores de tumores, genes que inhiben la metástasis e invasión tumoral, genes reguladores del ciclo celular, genes de reparación del ADN y genes inhibidores de la angiogénesis. , etc. Sin embargo, las limitaciones de los métodos de investigación actuales limitan la investigación exhaustiva sobre la metilación del ADN.

En los últimos años, los investigadores han estado explorando métodos cualitativos y cuantitativos para detectar sitios de metilación únicos o múltiples. Sin embargo, es difícil diseñar ubicaciones de cebadores para reacciones de extensión debido a la alta densidad de regiones polimórficas metiladas. Como nueva tecnología de análisis de secuencia, la tecnología de pirosecuenciación puede detectar rápidamente la frecuencia de la metilación y detectar cualitativa y cuantitativamente sitios de metilación en muestras, lo que proporciona una nueva forma de investigación de la metilación.

En principio, la pirosecuenciación es un método de análisis de secuencias mediante métodos sintéticos. La pirosecuenciación inicia una reacción en cascada enzimática a través del pirofosfato liberado después de que los nucleótidos se unen a la plantilla, lo que hace que la luciferina emita luz y la detecte. La tecnología se ha utilizado para detectar genotipos y haplotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y para identificar y tipificar bacterias y virus. ¿Una característica clave de esta tecnología está en Pyrogarm? La altura del pico que se muestra en el software proviene de los datos sin procesar del análisis de secuencia, y la frecuencia de los alelos en la plantilla de ADN mixto se puede detectar con precisión a través de la altura del pico.

Actualmente, en el estudio de la metilación, muchos informes sobre análisis cuantitativos de metilación utilizan bisulfito para tratar muestras metiladas y productos de PCR mixtos.

Como corrección, el principio fundamental es que el bisulfito puede convertir la citosina no metilada en uracilo, mientras que la citosina metilada permanece sin cambios en condiciones experimentales apropiadas. Por lo tanto, después de tratar la muestra con bisulfito y luego amplificarla mediante PCR, el sitio de metilación puede considerarse como un SNP C/T y su frecuencia genética es de 0 a 100. Aquí perfilamos a un investigador que utiliza pirosecuenciación.

En la reacción de pirosecuenciación se detectaron simultáneamente seis sitios de metilación. Este método también se puede utilizar en tejidos incluidos en parafina con alta reproducibilidad y precisión. Se seleccionó para la detección la isla CpG en el sitio de inicio de la transcripción de la glutatión-S-transferasa π (GSTP1). Estos sitios no están metilados en el tejido prostático normal. Sin embargo, estaba altamente metilado en muestras de tumores. La PCR amplificó un fragmento de 140 pb que contenía 17 sitios polimórficos metilados y se utilizaron 4 cebadores de secuenciación para estudiar los 15 sitios (Tabla 1). Los cebadores de secuenciación se diseñaron mediante un software de diseño de cebadores de secuenciación SNP en línea (pirosecuenciación AB).

Algunos sitios polimórficos de metilación fueron reemplazados por las bases más probables para reducir el número de cálculos. Luego, los cebadores de secuenciación se detectan manualmente para detectar posibles discrepancias. Además, ejecute un control en blanco en el analizador de ADN PSQ 96MA para restar el fondo causado por los cebadores de secuenciación, los cebadores marcados con biotina o las plantillas.

El diseño del cebador de PCR coincide exactamente con la plantilla y no cubre ninguna región de polimorfismo de metilación. GSTP1 se amplificó utilizando 10 ng de muestra de ADN convertida con bisulfito o 10 fmol de producto de PCR purificado, 10 pmol de cebadores directos (5'-gtgattagtattgg-3') e inversos (5'-biotina-aacttaaaacccatc-3'). del sitio de inicio de la transcripción, la longitud del fragmento amplificado es de 144 pb. El sistema de reacción es Tris-SO4 60 mM, pH 8,9, (NH4) 2SO4 18 mm, MgSO4 1 mm, DNTPS 200 μm, polimerasa de alta fidelidad de ADN Taq de platino 3 U, volumen final 50 μL, ajuste del ciclo de PCR: desnaturalización a 95 °C durante 4 minutos, luego repita 95 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 45 segundos y 72 °C durante 20 segundos. El paso de extensión final se realizó a 72°C durante 4 min y se detuvo la reacción. Las reacciones de PCR se realizaron en un Eppendorf Mastercycler 96.

En los genomas de mamíferos, la metilación del ADN se refiere a la fuente del quinto carbono de la citosina en los dinucleótidos CpG.