Existen varios métodos de pruebas genéticas, ¿cuál es mejor?

El principio básico es: la membrana de nitrocelulosa o la membrana de filtro de nailon tiene una fuerte capacidad de adsorción para el ADN monocatenario. Después de la electroforesis, el gel se somete a un tratamiento de desnaturalización del ADN. cubierto con la membrana de filtro anterior, presione varias capas de papel absorbente seco encima y, con la ayuda de su efecto de succión en la solución salina profunda, el ADN monocatenario del gel se transferirá a la membrana de filtro. La transferencia es in situ, es decir, la posición del fragmento de ADN permanece inalterada. Una vez completada la transferencia, el ADN cocido a 80 °C se fijará in situ en la membrana.

Una vez transferido el fragmento genético específico a la membrana in situ, se puede hibridar con la sonda marcada con isótopos y se mostrará la señal de hibridación. La hibridación se lleva a cabo normalmente en una bolsa de plástico. La membrana de filtro de hibridación antes mencionada se coloca en la bolsa después de añadir la solución de hibridación que contiene la sonda desnaturalizada, la sonda de ADN monocatenaria y las moléculas de ADN del gen monocatenario fijadas en la misma. Se permite que la membrana se vuelva álcali a una temperatura determinada. Totalmente combinado desde los principios básicos hasta los complementarios. La unión es específica, por ejemplo, sólo el ADN del gen de la β-globina puede unirse a la sonda de β-globina. Después de la hibridación, se lavaron las sondas no combinadas de la membrana, se colocó una película de rayos X sobre la membrana y se realizó la autorradiografía en una caja oscura bajo la luz del sol. El fragmento de ADN unido a la sonda marcada con isótopos mostrará una banda de hibridación negra. La eliminación o mutación del gen puede provocar que la banda se elimine o cambie de posición.

2. Reacción en cadena de la polimerasa

En los últimos años, el análisis genético y la tecnología de ingeniería genética han logrado avances revolucionarios, principalmente debido al desarrollo y aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La aplicación de la tecnología PCR puede amplificar genes específicos o fragmentos de ADN de cientos de miles a millones de veces in vitro en sólo 2 o 3 horas. Los fragmentos amplificados pueden observarse directamente mediante electroforesis o utilizarse para análisis posteriores. De esta manera, no es necesario observar una pequeña cantidad de genes de copia única a través de isótopos para aumentar su sensibilidad, sino que se pueden observar directamente después de la amplificación hasta un millón de veces, y el diagnóstico que originalmente tomaba una o dos semanas se puede acortar. a unas pocas horas.

3. Polimorfismo de longitud de fragmento amplificado

El polimorfismo de longitud del ADN satélite pequeño y del ADN microsatélite se puede detectar mediante electroforesis después de la amplificación por PCR y usarse para causar enfermedades. Análisis de ligamiento genético, este método de diagnóstico se denomina análisis de enlace del polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (Amp-FLP). Después de la amplificación por PCR, la diferencia entre los productos, es decir, fragmentos alélicos, a veces es de sólo unos pocos nucleótidos, por lo que se requiere electroforesis en gel de poliacrilamida para la separación e identificación. Este método se utiliza principalmente para el análisis de ligamiento cuando se desconoce la naturaleza de la mutación.

Método de diagnóstico con sonda de oligonucleótido específica de alelo

Cuando se desconoce el sitio de la mutación y la naturaleza del gen. completamente comprendido. En este caso, las sondas de oligonucleótidos específicas de alelo (oligonucleótidos específicos de alelo, ASO) se pueden sintetizar y marcar con isótopos o no isótopos para el diagnóstico. Las sondas suelen tener una longitud de unos 20 pb. Cuando se utiliza para detectar mutaciones puntuales, generalmente es necesario sintetizar dos sondas, una que sea completamente consistente con la secuencia del gen normal y pueda hibridarse de manera estable con ella, pero que no pueda hibridarse con la secuencia del gen mutante y la otra que sea consistente con el gen mutante; secuencia y puede hibridarse con la secuencia del gen mutante. Se hibrida de manera estable, pero no puede hibridarse de manera estable con secuencias de genes normales. De esta manera, se pueden distinguir genes con una sola mutación de base.

La PCR se puede combinar con ASO, es decir, tecnología PCR-ASO, es decir, primero los fragmentos relacionados con genes que contienen los puntos de mutación se amplifican in vitro y luego se hibridan por puntos con la sonda ASO. Esto simplifica enormemente el método, ahorra tiempo y solo requiere una cantidad muy pequeña. cantidad de ADN genómico.

5. Método de diagnóstico del polimorfismo de conformación monocatenario

El polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP) se refiere a la posibilidad de que el ADN monocatenario pueda cambiar debido a diferentes secuencias de bases que provoquen diferencias conformacionales. , que provocará diferentes movilidades electroforéticas de ADN monocatenario de longitud igual o similar, que pueden usarse para la sustitución de bases individuales en el ADN, deleciones menores o la detección de manuscritos. Cuando se utiliza el método SSCP para verificar mutaciones genéticas, generalmente se diseña un par de cebadores cerca del fragmento de ADN que se sospecha que está mutado para la amplificación por PCR, y luego el producto amplificado se desnaturaliza con formamida, etc., y se somete a electroforesis en un gel de poliacrilamida. La diferencia en la conformación del ADN aparecerá como una diferencia en la posición de la banda electroforética, que puede usarse para hacer un diagnóstico.