¿Qué está pasando con el banco de genes? La biblioteca de genes se refiere a la colección de todos los genes de un determinado tipo biológico. Esta colección tiene la forma de una reorganización. La población de fragmentos de ADN del organismo se recombina con moléculas vector y luego se transforma en células huésped. Una única colonia (o placa) de células transformadas (o células vivas) cultivadas en medios selectivos es un clon del fragmento de ADN. La colección de todos los clones de fragmentos de ADN es la biblioteca genética de un organismo. La importancia de construir una biblioteca de genes no es solo almacenar información genética biológica en una forma recombinante estable, sino que, lo que es más importante, es la forma principal de aislar y clonar genes diana. En el caso de moléculas complejas de ADN cromosómico, un solo gen representa una proporción muy pequeña. Para aislarlo de un genoma enorme, generalmente es necesario realizar primero la amplificación, por lo que es necesario construir una biblioteca de genes. En muchos casos, el aislamiento de genes diana es inseparable de las bibliotecas de genes. Además, las bibliotecas de genes también son una base importante para el mapeo genómico complejo. La construcción de bibliotecas de genes incluye los siguientes procedimientos básicos: ① Extracción y fragmentación de ADN, o síntesis de ADNc. ②Selección y preparación del transportista. ③ Conecte el fragmento de ADN o ADNc al vector. ④El recombinante transforma las células huésped. ⑤ Detección de células transformadas. La clonación genética se completa cuando se obtiene una célula huésped que contiene el recombinante. La clonación de genes es sólo la base para el aislamiento de genes. Después de la clonación de genes, los genes clonados deben separarse, es decir, los genes diana se separan de la biblioteca por diversos medios. Para aislar el gen diana es necesario detectarlo y analizarlo, como secuenciación, transcripción y traducción in vitro, experimentos de complementación funcional, etc. A través de estos experimentos se determinó la estructura y función del gen. Sólo así se puede aislar el gen diana. Por lo tanto, la clonación de genes, el aislamiento de genes clonados y la identificación de genes aislados son los contenidos principales de la tecnología de biblioteca de genes para aislar genes diana. 1. Categoría 1 del banco de genes. Bibliotecas genómicas y bibliotecas de ADNc Según los tipos de genes, las bibliotecas de genes se pueden dividir en bibliotecas genómicas y bibliotecas de ADNc. Una biblioteca genómica se refiere a una colección formada cortando todo el ADN genómico de un organismo en fragmentos de ADN de una determinada longitud y clonándolos en determinados vectores. Una biblioteca de ADNc se refiere a una colección de clones formados ligando fragmentos de ADNc de ARNm transcritos en una determinada etapa de desarrollo de organismos con vectores. Las bibliotecas de genomas se dividen en bibliotecas de genomas nucleares, bibliotecas de genomas de cloroplastos y bibliotecas de genomas mitocondriales según la fuente de ADN. La diferencia entre bibliotecas genómicas y bibliotecas de ADNc es que las bibliotecas de ADNc dependen del tiempo. El donante de información en la construcción de bibliotecas es el ARNm total de las células dentro de un cierto tiempo y espacio. Refleja la expresión genética de un determinado tejido (u órgano) de un organismo en un determinado período de desarrollo y en determinadas condiciones ambientales a nivel de transcripción. No puede contener todos los genes de un organismo. En cierto sentido, puede expresar la información funcional del genoma. Además, las bibliotecas de ADNc sólo reflejan la estructura molecular del ARNm. El ADNc no contiene las secuencias espaciadoras ni las regiones reguladoras de los genes eucarióticos, por lo que no es un gen real. Al construir una biblioteca genómica, el donante de información genética es el ADN genómico, por lo que no hay un período de desarrollo ni especificidad de tejido u órgano. Una biblioteca genómica completa contiene todos los clones de las regiones codificantes y no codificantes del ADN genómico. Cada gen de un organismo biológico tiene su clon en la biblioteca, y los fragmentos del gen clonado contienen secuencias espaciadoras, por lo que la biblioteca del genoma realmente puede mostrar toda la información estructural del genoma. En la actualidad, estos dos tipos de bibliotecas de genes se han utilizado eficazmente en ingeniería genética. Cuál elegir depende principalmente del propósito del experimento. Al aislar genes de virus de ARN, estudiar secuencias de proteínas funcionales y aislar genes expresados ​​específicamente en tejidos o etapas de desarrollo específicos, se deben construir bibliotecas de ADNc. Al estudiar secuencias que no están presentes en las moléculas de ARNm y mapear el genoma, es necesario construir bibliotecas de genoma nuclear. 2. Bibliotecas de clones y bibliotecas de expresión Según las funciones de las bibliotecas de genes, se pueden dividir en bibliotecas de clones y bibliotecas de expresión. Las bibliotecas de clones se construyen a partir de vectores de clonación. El vector contiene replicones, múltiples sitios de clonación y marcadores de selección, y los fragmentos clonados pueden propagarse mediante cultivo bacteriano. Utilice vectores de expresión para construir bibliotecas de expresiones. Además de los elementos anteriores, el vector también contiene secuencias que controlan la expresión génica (como promotor, secuencia SD, ATG, terminador, etc.), que pueden expresar el producto codificante del fragmento clonado en células huésped. Los vectores de expresión se pueden dividir en vectores de expresión de proteínas de fusión y vectores de expresión de proteínas naturales. Las sondas de ácido nucleico se utilizan principalmente para aislar clones diana a partir de bibliotecas de clones. Pueden ser sondas de oligonucleótidos sintetizadas a partir de secuencias de proteínas o sondas de secuencias homólogas de la misma especie o género.

Al aislar clones diana de una biblioteca de expresión, dado que la proteína producto de expresión del fragmento de clon tiene antigenicidad y actividad biológica, además de sondas de ácido nucleico, también se pueden usar sondas inmunológicas y funciones biológicas para el cribado. Esta biblioteca de expresión es adecuada para aislar genes diana cuya secuencia de aminoácidos de proteínas se desconoce y no se puede detectar con sondas de ácidos nucleicos. 3. Bibliotecas de genes de diferentes vectores Actualmente, los vectores utilizados para construir bibliotecas de genes incluyen principalmente plásmidos, fagos, cósmidos y cromosomas artificiales. Hay muchos operadores diferentes dentro de cada categoría. Son adecuados diferentes vectores para construir diferentes bibliotecas de genes. (1). Biblioteca de plásmidos El plásmido es el primer vector utilizado para la clonación de genes. Existen diversos plásmidos comerciales para clonación, expresión y secuenciación, adecuados para diferentes tareas. Sin embargo, en la construcción de bibliotecas de genes, dado que los plásmidos son relativamente pequeños y sólo pueden acomodar fragmentos más pequeños que ellos mismos, no pueden usarse para construir bibliotecas de genomas nucleares y generalmente solo se usan para construir bibliotecas de clones de secuencia corta. Por ejemplo, las moléculas de ADN de cloroplasto son muy pequeñas y se pueden utilizar plásmidos para construir bibliotecas de ADN de cloroplasto. Se pueden utilizar vectores plasmídicos para construir bibliotecas de ADNc biológico. Pero sólo funciona para ARNm de gran abundancia. (2) Biblioteca de fagos Hay muchos vectores de fagos y sus vectores derivados que se utilizan actualmente para la clonación de genes, como el vector de fago M13 monocatenario, el vector de fago lambda, el vector de fago P1, las partículas de fago (fagémido o fásmido), etc. Entre ellos, los bacteriófagos son los más utilizados. El λ-DNA es una estructura bicatenaria con una longitud de 49 kb. Hay un extremo adhesivo de 12 nucleótidos en ambos extremos de la molécula lineal, llamado sitio cos. Hay aproximadamente 1,5 kb de región genética no esencial en la molécula, también llamada "región de llenado". Las secuencias a ambos lados de la "región de llenado" contienen todos los genes necesarios para su proliferación, llamados brazo izquierdo y derecho. brazo. El "área de relleno" puede ser reemplazado por ADN exógeno para formar un recombinante, que es la base estructural para que se convierta en un vector de clonación. Debido a la limitación de la capacidad de empaquetamiento de la cabeza del fago, el tamaño molecular del ADN λ recombinante sólo puede estar entre 39 y 52 kb. (3) El cósmido, también conocido como plásmido cósmido, es un tipo especial de vector plasmídico compuesto por la secuencia COS del fago lambda, la secuencia del replicón del plásmido y la secuencia del gen de resistencia a los antibióticos. La secuencia COS es necesaria para empaquetar el ADN en partículas de fagos. Los replicones suelen utilizar ColEl o pMB1 como sitio de origen de replicación. Este cósmido posee algunas propiedades del fago lambda. Después de clonar fragmentos de ADN extraños de tamaños apropiados in vitro y empaquetarlos en partículas de fagos, se pueden transducir eficientemente células huésped de E. coli que son sensibles a la entrada de fagos. Circularizado por el fago lambda dentro de la célula huésped, pero no puede pasar por el ciclo lítico y no puede formar partículas de fago de progenie (porque la molécula no tiene todos los genes necesarios para ingresar al fago). También tiene las propiedades principales de un vector plasmídico y puede replicarse en las células huésped como otros plásmidos, al igual que los plásmidos relajados. Una cantidad adecuada de cloranfenicol puede promover la amplificación. Debido a los genes de los antibióticos, se pueden detectar recombinantes para detectar resistencia a los antibióticos. Cuando se construye el vector cósmido, se añaden múltiples sitios de clonación al gen de inactivación por inserción. Los vectores cósmidos son moléculas relativamente pequeñas (2,8-24 KB), pero su capacidad de clonación es muy alta. Se requiere que la longitud del ADN extraño sea de 30 a 45 KB, y el límite superior es casi el doble que el del fago vector (23 kb). Por lo tanto, los vectores cósmidos tienen ventajas considerables en la construcción de bibliotecas de genomas nucleares y pueden clonar genes vegetales completos, incluida la región reguladora 3,5'. (4). Biblioteca de cromosomas artificiales El vector de cromosomas artificiales es un vector artificial que utiliza elementos funcionales de cromosomas eucarióticos o genomas procarióticos para clonar fragmentos de ADN de más de 50 KB. Algunos de estos vectores pueden usarse para clonación y transformación directa, y son buenos vectores para estudios de función genética. Las bibliotecas de cromosomas artificiales desarrolladas en los últimos años incluyen la biblioteca YAC, la biblioteca BAC, la biblioteca BIBAC, la biblioteca PAC y la biblioteca TAC. 2. Construcción de una biblioteca de genoma nuclear La construcción de una biblioteca de genoma nuclear utiliza principalmente un vector de reemplazo de fago lambda o un vector cósmido. 1. Número de clones de biblioteca aleatorios Una biblioteca aleatoria significa que el número de moles de ADN que representan todas las partes del genoma es igual. Para biblioteca aleatoria: n = ln(1-p); Ln(1-x/y) N: número de clones p: valor de probabilidad establecido (por ejemplo, 0,99, lo que significa que la probabilidad de encontrar cualquier secuencia de la biblioteca cuando los fragmentos están distribuidos aleatoriamente no es inferior a 0,99) x: tamaño promedio de los insertos (15 ~ 20 kb) y: tamaño del genoma (kb) cuando una biblioteca de genes que contiene 5 1x 105 clones cubre 5 veces el genoma. Cuando los fragmentos se distribuyen aleatoriamente, la probabilidad de encontrar cualquier secuencia de la biblioteca no es inferior a 0,99. Se pueden generar fragmentos aleatorios mediante escisión mecánica o digestión con enzimas de restricción.