¿Cómo se realizaba la clonación molecular antes de la invención de la tecnología PCR?
El trabajo de investigación más llamativo de Kornberg fue probar experimentalmente la replicación del ADN y aislar la enzima necesaria para la replicación a mediados de la década de 1950. Esto se refleja en su famoso artículo "Síntesis enzimática". of DNA" publicado en 1956, por el que ganó el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1959. ?
Antes de 1953, la naturaleza material de los genes había sido un problema que preocupaba a los biólogos de todo el mundo. El 25 de abril de 1953, "Nature" publicó el modelo de estructura de doble hélice del ADN de J. Watson y F. Crick, que no solo reflejaba la infinita diversidad de moléculas de ADN, sino que también propuso inmediatamente un posible mecanismo para la autorreplicación del ADN. moléculas, creando seres vivos Los científicos de repente aceptaron que la esencia material de los genes es el ADN. Sin embargo, aunque el modelo de estructura de doble hélice del ADN se basa en muchos resultados experimentales, todavía necesita ser probado experimentalmente. En particular, ¿es el ADN realmente una molécula autorreplicante? Después de que se publicó el modelo de la estructura de doble hélice del ADN, Kornberg utilizó este modelo como base de su imaginación y utilizó métodos experimentales para estudiar la replicación del ADN. Rápidamente logró el éxito y publicó los resultados preliminares en 1956. Una de las razones de su éxito fue que realizó un análisis correcto: creía que aunque los monómeros que componen la molécula de ADN son cuatro desoxinucleósidos monofosfatos, las materias primas para sintetizar el ADN no son cuatro desoxinucleósidos monofosfatos, sino cuatro desoxinucleósidos trifosfato. Los cuatro desoxinucleósidos trifosfatos son deficientes en 1, los cuatro desoxinucleósidos difosfatos o los cuatro desoxinucleósidos monofosfatos son deficientes. También planteó la hipótesis de que las células deben tener las enzimas necesarias para sintetizar el ADN. Así que trituró E. coli, añadió cuatro desoxinucleósidos trifosfato (al menos uno de los cuales estaba marcado radiactivamente para comprobar los resultados del experimento) y añadió un poco de ADN a modo de "plantilla" (como el ADN del timo de ternera, E. coli y ADN del fago T2 de E. coli). La solución mezclada se dejó reposar a 37°C durante 30 minutos en presencia de iones de magnesio. Se descubrió que el marcador radiactivo había entrado en la parte del ADN, lo que indicaba que había moléculas de ADN recién sintetizadas. La molécula de ADN recién sintetizada, es decir, el producto experimental, se puede separar de la materia prima del monómero de desoxinucleósido trifosfato mediante precipitación con ácido perclórico. Kornberg midió la composición de bases del ADN producto y descubrió que eran sorprendentemente similares a sus respectivas composiciones de ADN molde, lo que demostró plenamente que la especificidad del ADN recién sintetizado estaba determinada por la pequeña cantidad de ADN molde añadido, pero la cantidad era mucho mayor. aumentó. . ¡El ADN es de hecho una molécula autorreplicante!
Por cierto, más tarde la gente aprendió que la síntesis de ADN también requiere un "cebador" para proporcionar el grupo hidroxilo terminal 3', lo que permite que la ADN polimerasa polimerice los desoxinucleótidos a partir de allí para formar ADN. Kornberg trató químicamente el ADN molde, provocando algunas roturas, formando así algunos grupos hidroxilo terminales 3' ya preparados. Esto era desconocido en ese momento. ? Kornberg no paró tras ganar el Premio Nobel. Sabía claramente que el ADN que sintetizó fuera de su cuerpo estaba inactivo. Entonces, ¿podemos sintetizar moléculas de ADN activas in vitro? En 1967, utilizó el ADN del fago de E. coli φⅹ174 como material para realizar experimentos de replicación in vitro. El genoma de φⅹ174 es un ADN circular monocatenario con un total de 5386 nucleótidos. Lo que sucede dentro de la célula es que cuando φⅹ174 infecta E. coli, el ADN circular monocatenario ingresa a la bacteria y su cadena complementaria se sintetiza rápidamente de acuerdo con el principio de apareamiento de bases para formar un "ADN replicado" circular bicatenario. Generalmente, la hebra única de la partícula del fago se denomina "hebra +" y la hebra complementaria sintetizada después de entrar en la bacteria se denomina "hebra -". Cuando se replican en bacterias, muchas cadenas + se sintetizan mediante el método del "círculo rodante" utilizando la cadena - como plantilla. Estas cadenas + y capas de proteínas se construyen en el nuevo φ ⅹ 174, que se libera de las bacterias. Kornberg utilizó básicamente el método utilizado en 1956 (pero añadió una ligasa para conectar el grupo hidroxilo terminal 3' del último nucleótido de la cadena recién sintetizada al grupo fosfato terminal 5' del primer nucleótido (para formar un anillo). ), use φ ⅹ 174+DNA como plantilla para sintetizar - hebra in vitro, y luego use - hebra como plantilla para sintetizar in vitro. La cadena de ADN φⅹ174+ sintetizada in vitro puede infectar E. coli, replicarse en la bacteria y eventualmente liberar muchas partículas del fago φⅹ174 de la bacteria, que tienen todas las características del fago φⅹ174 original. Así, por primera vez, los humanos sintetizaron moléculas de ADN biológicamente activas en un tubo de ensayo. Los logros de Kornberg en la síntesis de ADN in vitro fueron de gran alcance. El primero trata sobre las enzimas necesarias para la replicación del ADN.
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La ADN polimerasa contenida en el extracto de E. coli previsto por Kornberg al inicio del experimento fue aislada y purificada por él en 1957, denominada "ADN polimerasa I de E. coli", también conocida como "ADN polimerasa I". "Enzima" todavía se utiliza comúnmente en laboratorios de genética molecular de todo el mundo. No solo tiene actividad polimerasa, sino que también tiene actividades exonucleasa 5′→3′ y exonucleasa 3′→5′. Hoy en día, cuando utilizamos la tecnología de hibridación molecular de ADN para el aislamiento de genes, el análisis de la estructura de los genes, el diagnóstico de genes y otras investigaciones, debemos utilizar sondas genéticas marcadas con isótopos radiactivos. El método de traducción de mellas comúnmente utilizado de las sondas genéticas marcadas utiliza la ADN polimerasa de Escherichia coli ⅰ; las características tanto de la actividad polimerasa como de la actividad exonucleasa 5′→3′, y su proceso de reacción es también el proceso de síntesis de ADN en Kornberg in vitro. Por tanto, aunque posteriormente se demostró que la ADN polimerasa III de E. coli juega un papel importante en la replicación de las células de E. coli, más que la ADN polimerasa I, en el laboratorio de genética molecular la importancia de la ADN polimerasa I de E. coli es secundaria. a la del laboratorio. La vanguardia de las enzimas de uso común. ?
En 1970, el bioquímico danés H. Klenow utilizó la subtilisina para escindir la ADN polimerasa I de E. coli y obtuvo dos fragmentos tras electroforesis. El fragmento grande conserva la actividad de la polimerasa y la exonucleasa 3'→5', pero pierde la actividad de la exonucleasa 5'→3', y se denomina "fragmento de Klenov", también conocido como "fragmento de Klenow" enzima Fu". Otro método de "cebado aleatorio" comúnmente utilizado para marcar sondas genéticas requiere el uso de enzimas Klenov en lugar de enzimas Kornberg. En segundo lugar, los logros de Kornberg condujeron directamente a varios proyectos ganadores del Premio Nobel. ?
Hasta el momento, incluido el "Proyecto Genoma Humano" finalizado en abril de 2003, se han determinado fagos, virus, viroides, bacterias, protozoos, hongos, plantas, animales, orgánulos y plásmidos de más de 65.438+0,000 secuencias de ADN genómico. La secuenciación del ADN comenzó con el método de "suma y resta" establecido por el bioquímico británico F. Sanger en 1975. Utilizó este método por primera vez en 1977 para determinar la secuencia completa de nucleótidos del ADN genómico φⅹ174. En los últimos 30 años, la secuenciación de ADN ha pasado de ser una secuenciación semiautomática a una secuenciación automatizada por instrumentos, pero sus principios básicos aún no han saltado de la categoría de "suma y resta" de Sanger La "fuente" de la "suma y resta". es el experimento de síntesis de ADN in vitro de Kornberg. Intenta controlar la síntesis enzimática del ADN para producir cadenas complementarias de diferentes longitudes, determinando así el orden en el que se organiza un nucleótido. Entre ellas, la ADN polimerasa utilizada es la enzima Klenoff. Sanger ganó el Premio Nobel de Química en 1980 por establecer el método de secuenciación del ADN.