¿Qué es la detección de expresión de genes extraños?
Para detectar si el gen exógeno se ha transformado con éxito, primero se detecta el gen informador y luego se detecta el gen exógeno objetivo. Propósito La expresión de genes extraños se puede dividir en dos niveles: transcripción y traducción. La transcripción es el proceso de sintetizar ARNm usando ADN como plantilla, y la traducción se refiere a la traducción en proteínas usando ARNm como plantilla. La detección de la expresión del gen objetivo también se puede realizar en dos niveles: detectando el ARNm en el nivel de transcripción y detectando proteínas en el nivel de traducción.
1. Detección enzimática de genes indicadores
Los principales genes indicadores, como el gen Gus, el gen Cat, el gen de la opina sintasa, el gen NptⅡ y el gen de la luciferasa, se pueden utilizar según sus respectivas funciones. , se utiliza la detección enzimática.
2. Detección de genes extraños a nivel de transcripción.
La hibridación Northern (Northern blotting) utiliza ARN como sonda para detectar el ARNm específico de transcritos de genes exógenos. La hibridación Northern también incluye la hibridación por transferencia puntual y la hibridación por transferencia. La hibridación por puntos solo requiere que la muestra de ARN se coloque en una membrana de fase sólida para hibridar directamente con la sonda, pero solo puede identificar si el gen extraño está transcrito, mientras que la hibridación por transferencia Northern requiere la separación electroforética de la muestra de ARN y luego transferirla a; la membrana de fase sólida y luego se hibrida con la sonda, el estado de transcripción del gen extraño se puede analizar con más detalle. La hibridación Dot-Northern transfiere el extracto de ARN total directamente a la membrana de hibridación a través de un inyector de filtro poroso, y los pasos restantes son los mismos que los de la hibridación Northern. La hibridación Northern tiene una baja tasa de detección de ARNm de baja abundancia en las células.
3. Detección de genes extraños a nivel de traducción
La transferencia Western se suele utilizar para detectar genes extraños a nivel de traducción. La hibridación Western es un método de detección de proteínas específico que integra electroforesis, transferencia e inmunoensayo de proteínas. Cuando el gen exógeno transformado se expresa normalmente, las células vegetales transgénicas contienen una cierta cantidad de la proteína diana. Extraiga la proteína total o la proteína objetivo de las células vegetales, disuelva la muestra de proteína en una solución que contenga detergente y agente reductor, separe la proteína mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y separe cada banda de proteína separada in situ. Transferida a una membrana en fase sólida, la membrana se incuba en una solución proteica altamente concentrada para bloquear loci no específicos. Luego agregue un anticuerpo específico (anticuerpo primario). Después de que la proteína objetivo en la transferencia se una al anticuerpo primario, agregue un anticuerpo secundario que pueda unirse específicamente al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario se ha marcado de antemano y se basa la detección. sobre las propiedades del compuesto marcado sobre el anticuerpo secundario. A partir de los resultados de la prueba se puede saber si la proteína objetivo se ha expresado en las células vegetales analizadas, su concentración y su peso molecular aproximado.