¿Cuáles son los métodos de pruebas genéticas?
1. Secuenciación de primera generación
1.1 La secuenciación Sanger utiliza el método de secuenciación directa.
En 1977, Frederick Sanger y otros inventaron el método de terminación de cadena didesoxi, que más tarde se convirtió en la tecnología de secuenciación de genes más utilizada. En 2001, Allan Maxam y Walter Gibert inventaron el método de secuenciación Sanger, que se convirtió en el estándar de oro para las pruebas genéticas en los 10 años siguientes. El principio básico es que los trifosfatos de didesoxirribonucleósidos (ddNTP) carecen del 3'-OH necesario para la extensión de la PCR, por lo que cada vez que se agrega una molécula de ddNTP a la cadena de ADN, se terminará la extensión. Cada secuencia de ADN consta de cuatro reacciones independientes. Se mezclan plantillas, cebadores y ddNTP de cuatro nucleótidos marcados con radioisótopos diferentes con ADN polimerasa para formar fragmentos de diferentes longitudes. Hay una gran cantidad de fragmentos de ADN con el mismo punto de partida y diferentes puntos finales en el sistema de reacción. La electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida se puede utilizar para separar secuencias de ADN con diferencias de una sola base y obtener bandas de autorradiografía de radioisótopos. Lea la secuencia de bases de las dobles cadenas de ADN basándose en las tiras de electroforesis.
La secuenciación del genoma humano se basa en esta tecnología. La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación directa muy preciso, sencillo y rápido. En la actualidad, todavía tiene un gran valor práctico para la identificación de genes de algunas pequeñas muestras de enfermedades genéticas en la práctica clínica. Por ejemplo, la secuenciación directa del gen FGFR2 utilizando Sanger para confirmar el síndrome de Apert de un solo gen y la secuenciación directa del gen TCOF1 puede detectar hasta el 90% de las mutaciones asociadas con el síndrome de TreacherCollins. Vale la pena señalar que la secuenciación de Sanger diseña cebadores para los sitios de mutación de genes de enfermedades conocidas y realiza amplificación y secuenciación por PCR directa. Sólo es necesario amplificar el fragmento de exón que contiene un único punto de mutación y no es necesario amplificar todos los exones del gen donde se encuentra el punto.
Por lo tanto, es necesario localizar claramente el exón del gen donde se encuentra el sitio que se va a amplificar y la ubicación específica del punto, y diseñar cebadores para los fragmentos del exón de 150~200 pb en sentido ascendente y descendente, incluido este punto. . Además, a pesar de la aparición de NGS, la secuenciación de Sanger sigue siendo muy rentable y eficiente para la detección de genes causantes de enfermedades en un número limitado de enfermedades genéticas de un solo gen con loci claros. Hasta ahora, la secuenciación de Sanger sigue siendo el estándar de oro para las pruebas genéticas y el método principal para verificar los genes NGS en familias y controles normales.
Cabe destacar que el propósito de la secuenciación de Sanger es encontrar mutaciones genéticas específicas asociadas con enfermedades. Es difícil detectar casos de muestras grandes sin genes candidatos claros o con una gran cantidad de genes candidatos. Dichos estudios de secuenciación se basan en NGS con capacidades de secuenciación de alto rendimiento. Aunque la secuenciación Sanger tiene una alta precisión de análisis, su precisión también depende de la configuración del instrumento de secuenciación y de las condiciones de secuenciación. Además, la secuenciación de Sanger no puede detectar tipos de mutaciones genéticas, como grandes eliminaciones o variaciones en el número de copias, por lo que no puede realizar diagnósticos genéticos para algunas enfermedades genéticas relacionadas.
La secuenciación indirecta se utiliza para el análisis de vinculación en la versión 1.2.
Antes de la aparición de NGS, la estrategia internacionalmente aceptada para la clonación posicional de genes de enfermedades se basaba en la exploración de genes completos a gran escala y el análisis de vinculación. Los cromosomas humanos vienen en pares, uno del padre y otro de la madre. Cada par de cromosomas tiene los mismos genes en la misma ubicación, pero sus secuencias no son exactamente iguales, por eso se denominan alelos paternos y maternos.
Los marcadores genéticos son secuencias de ADN que exhiben polimorfismo en una población y pueden rastrear cualquier rasgo genético transmitido a través de un cromosoma, segmento cromosómico o locus dentro de una familia. Existe en todos, sólo que en un orden de magnitud diferente, y es heredable e identificable. Actualmente se utilizan marcadores genéticos de segunda generación, concretamente polimorfismos de secuencias repetidas, especialmente repeticiones cortas en tándem, también conocidos como marcadores de microsatélites.
El análisis de ligamiento es un método para estudiar la relación entre genes causantes de enfermedades y marcadores genéticos basado en el ligamiento. Si hay un marcador genético cerca de un gen que controla un determinado rasgo fenotípico, el gen puede ubicarse en una determinada posición del cromosoma en función de si existe una relación de vinculación entre el marcador genético y el gen propuesto y el grado de vinculación.
En 1986, Morton et al. propusieron el método LOD, que prueba principalmente la posibilidad de vinculación entre dos genes bajo una determinada tasa de recombinación. Si el valor LOD es positivo, se admite el enlace; si el valor LOD es negativo, se rechaza el enlace. Al calcular el valor LOD entre los marcadores microsatélites y el locus patógeno en la familia, se puede estimar inicialmente la distancia genética y el grado de vinculación entre ellos, determinando así la ubicación aproximada del gen en el cromosoma. Luego utilice el mapa de genes cromosómicos de la región para analizar la función y expresión de todos los genes en la región de ubicación, seleccione los genes candidatos apropiados para la detección de mutaciones y, finalmente, localice o clone el gen que causa la enfermedad.
Sin embargo, las pruebas genéticas mediante análisis de ligamiento tienen limitaciones importantes. No sólo requiere una gran cantidad de muestras genéticas, sino que generalmente también requiere muestras de sangre de pacientes con tres o más generaciones de familias genéticas. Además, la cantidad de datos es grande, el procesamiento es complejo, la velocidad de salida es lenta y el posicionamiento es inexacto (generalmente solo dentro de un cierto intervalo cromosómico), lo que hace que el trabajo de investigación sea pesado y el período de tiempo del posicionamiento de genes sea particularmente largo. Actualmente, todavía se utilizan polimorfismos de un solo nucleótido y repeticiones cortas en tándem para el análisis de ligamiento, pero los métodos clásicos de secuenciación indirecta, como el polimorfismo conformacional monocatenario, la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante y el análisis heterodúplex, todavía se han eliminado gradualmente. Estados Unidos, pero su uso como método de investigación aún es limitado en los países en desarrollo.
2. Secuenciación de próxima generación (NGS)
Incluye principalmente secuenciación del genoma completo (WGS), secuenciación del exoma completo (WES) y secuenciación de regiones específicas (TRS), todas las cuales son Next. -Tecnología de secuenciación de generación. En general, la tecnología NGS tiene las ventajas de un gran rendimiento, poco tiempo, alta precisión y rica información, lo que permite a los genetistas localizar con precisión genes de interés en poco tiempo. Sin embargo, estas diferentes tecnologías de secuenciación difieren significativamente en términos de rango de secuenciación, cantidad de análisis de datos, costo de secuenciación y tiempo. Si se elige el método adecuado, desempeñará un papel más eficaz en el diagnóstico clínico y la investigación científica.
2.1 La secuenciación de la región objetivo es una tecnología de chip genético de uso común.
Su principio de secuenciación se basa en el principio de hibridación del ADN. El ADN de la región del gen objetivo se enriquece mediante hibridación en chip o hibridación en solución con sondas personalizadas para la región del gen objetivo y luego se secuencia mediante tecnología NGS. Durante el proceso de secuenciación, se colocan miles de ADNc u oligonucleótidos en el chip para formar una matriz. Las sondas de nucleótidos de secuencias conocidas fijadas en el chip se emparejan con las secuencias de ácido nucleico marcadas fluorescentemente correspondientes en la solución. De acuerdo con la posición y la intensidad de la fuerte fluorescencia mostrada por el secuenciador, se obtiene la información de cada conjunto de matrices de puntos y luego se determina la composición de la secuencia del nucleótido objetivo mediante un algoritmo bioinformático. La región diana seleccionada para la secuenciación puede ser una secuencia de ADN continua o un fragmento distribuido en diferentes regiones del mismo cromosoma o en diferentes cromosomas. La tecnología de secuenciación de la región objetivo es un método muy bueno que puede detectar aún más mutaciones genéticas que estaban bloqueadas en un determinado segmento del cromosoma mediante análisis de ligamiento en el pasado, pero que no se pudo encontrar la mutación. En 2010, Nicholas et al. utilizaron chips de genotipado combinados con tecnología de análisis de ligamiento para descubrir con éxito un nuevo gen de microcefalia, WDR62, y el artículo se publicó en la revista NatGenet. Estudios similares identificaron ocho sitios de mutación candidatos en el cáncer de páncreas familiar y descubrieron el gen de susceptibilidad TSPAN12 en la vitreorretinopatía exudativa familiar.
La tecnología de secuenciación de chips genéticos puede estudiar más a fondo genes o regiones específicas que han sido seleccionadas dentro del rango objetivo mediante análisis de vinculación o detección del genoma completo. Es un medio eficaz para resolver el problema de que el análisis de vinculación no pueda encontrar. genes que causan enfermedades. La tecnología de chips genéticos tiene ventajas obvias en la detección de mutaciones genéticas conocidas y puede detectar de forma rápida y completa mutaciones genéticas diana. Al mismo tiempo, debido a la limitación del área objetivo, el rango de secuenciación se reduce considerablemente y el tiempo y el costo de secuenciación también se reducen en consecuencia. Sin embargo, la cantidad de ADN necesaria para las pruebas de chips genéticos es grande. Debido a que el ADN extraído tiene riesgo de degradación, es mejor utilizar sangre completa congelada como muestra de sangre para la investigación de chips genéticos, a fin de garantizar completamente la cantidad de ADN disponible para la detección.
2.2 Secuenciación del exoma completo (WES)
El exoma es la suma de todas las secuencias codificantes de proteínas en el ADN genómico de un único individuo. La secuencia de exones humanos representa aproximadamente el 65.438 ± 0% de toda la secuencia del genoma humano, pero contiene aproximadamente el 85% de las mutaciones que causan enfermedades. WES es un método de análisis genético que utiliza tecnología de captura de secuencias para capturar y enriquecer el ADN en toda la región del exón y luego realiza una secuenciación de alto rendimiento.
Las plataformas tecnológicas utilizadas incluyen principalmente el sistema de captura de exones completos SeqCapEZ de Roche, la tecnología Solexa de Illumina y el sistema de enriquecimiento de secuencias dirigidas a exones SureSelect de Agilent. El área objetivo capturada está entre 34 y 62 M, incluidas no solo áreas codificadas, sino también algunas áreas no codificadas. El proceso de secuenciación NGS incluye principalmente la preparación de bibliotecas de secuenciación de ADN, puentes de anclaje, amplificación por PCR, secuenciación de extensión de base única y análisis de datos. El secuenciador captura los fragmentos de bases mezclados con diferentes etiquetas fluorescentes y las computadoras convierten las señales fluorescentes en picos de secuenciación y secuencias de bases de diferentes colores. Los resultados de la secuenciación de genes se comparan con bases de datos internacionales autorizadas, como la base de datos NCBI SNP y la base de datos Thousand Genomes, para determinar en última instancia si se trata de un gen mutado.
Desde la llegada de la tecnología NGS, WES ha logrado logros sin precedentes en la identificación de genes que causan enfermedades clínicas. Estos resultados no sólo se centran en enfermedades genéticas de un solo gen, sino que también encuentran una gran cantidad de genes relacionados en enfermedades complejas afectadas por múltiples genes. Descubrimiento de nuevos genes o nuevas mutaciones en genes conocidos en enfermedades monogénicas, como la retinosis pigmentaria y la displasia ósea terminal. Se han descubierto nuevos genes causantes de enfermedades raras como el síndrome de Kabuki, la hiperlipidemia mixta familiar y la ataxia espinocerebelosa. Al mismo tiempo, también se han logrado resultados fructíferos en la investigación de tumores como el cáncer de pulmón de células pequeñas y la leucemia linfocítica crónica, así como en la investigación de enfermedades complejas como la obesidad y la displasia cortical cerebral.
La tecnología WES tiene ventajas obvias sobre otras tecnologías de secuenciación en términos de rango de detección y tasa de detección. Por ejemplo, WES se puede utilizar para una mayor detección genética e identificación de muestras que no se pueden detectar mediante la secuenciación de Sanger y la secuenciación de chips genéticos. La tecnología WES puede obtener una cobertura más profunda y datos más precisos que los métodos tradicionales de Sanger. Debido al aumento sustancial en la cantidad de información, WES puede obtener más información sobre regiones codificantes individuales, convirtiéndose así en un medio eficaz para detectar genes que causan enfermedades y loci de genes de susceptibilidad. En comparación con el método de análisis de vinculación, WES no tiene requisitos muy estrictos sobre los pedigríes. En una familia con una enfermedad genética de un solo gen, hay de 2 a 3 pacientes y 1 persona normal. No es necesario identificar el gen causante durante tres generaciones consecutivas. WES hace posible estudiar familias que antes no estaban disponibles porque no se requieren familias genéticas estrictas durante tres generaciones. No sólo es un buen método de investigación para enfermedades genéticas de un solo gen, sino que también puede realizar estudios comparativos a gran escala sobre muchas enfermedades comunes, como tumores, diabetes, etc.
2.3 Resecuenciación del genoma completo (WGS)
WGS consiste en secuenciar los genomas de diferentes individuos de especies con secuencias genómicas conocidas. Después del análisis de los datos, las secuencias se empalman y ensamblan. o se secuencian diferentes tejidos. La secuenciación, un método de investigación para analizar mutaciones somáticas. Aunque WES puede encontrar rápida y exhaustivamente todas las mutaciones en el genoma de un individuo y así descubrir diferencias entre individuos, no puede detectar genes de forma eficaz en regiones distintas de los exones. En este caso, actualmente es necesaria la detección del genoma completo con ayuda de WGS. Sin embargo, debido a que el genoma humano es tan grande, es difícil lograr la profundidad de secuenciación requerida con la secuenciación del genoma completo de un solo extremo. Por lo tanto, se requiere una secuenciación repetida o una secuenciación de extremos emparejados, lo que aumentará en gran medida el costo de la secuenciación y reducirá la precisión de los resultados porque no se puede lograr una profundidad de secuenciación suficiente. Para el diagnóstico clínico de enfermedades y la investigación científica general, su alto costo de detección también es inasequible. No obstante, para algunos temas de investigación clínica y científica que no pueden resolverse con WES, es necesario realizar pruebas genéticas más completas con la ayuda de WGS.
3. Punto de vista
La aparición de NGS ha añadido infinita vitalidad e imaginación a las tecnologías genómicas emergentes. En particular, son alentadores la llegada de los chips genéticos, su vitalidad en las aplicaciones clínicas de detección de enfermedades y diagnóstico genético a gran escala y su modelo de desarrollo comercial. La oftalmología es la disciplina más común que se ocupa de enfermedades de un solo gen. La detección de la enfermedad de Labbeth mediante tecnología de chips ha permitido diagnosticar claramente muchas atrofias ópticas de causas desconocidas. El glaucoma primario de ángulo abierto es la enfermedad ocular que causa ceguera más insidiosa y peligrosa en oftalmología. La identificación de sus genes o mutaciones causantes tendrá un valor clínico muy importante y un enorme valor comercial en la detección de enfermedades. El uso de la tecnología de chips genéticos en el cribado de la diabetes en recién nacidos puede ser más rápido, más completo y más económico, evitando la complejidad y las omisiones de la secuenciación de primera generación.
La tecnología de chips genéticos tiene más perspectivas de desarrollo en el diagnóstico prenatal. Las mujeres embarazadas pueden realizar pruebas de detección de enfermedades genéticas siempre que se sometan a un análisis de ADN en sangre, evitando las limitaciones y riesgos de la amniocentesis, una prueba invasiva para extraer líquido amniótico.
Actualmente, con la mejora de la tecnología de pruebas genéticas y la reducción continua de los costos de las pruebas, es posible desarrollar pruebas genéticas individualizadas a gran escala en un futuro próximo. Al mismo tiempo, con la detección en profundidad de los genes de susceptibilidad a los medicamentos y a las enfermedades, se realizará una medicina personalizada basada en pruebas genéticas. Hay motivos para creer que a medida que el nivel de vida de las personas siga mejorando y la concienciación sobre la salud siga aumentando, las perspectivas de aplicación de las pruebas genéticas en el desarrollo médico futuro serán muy prometedoras.