Una nota sobre la luciferasa dual
Respuesta: Los experimentos con un solo gen informador a menudo se ven afectados por diversas condiciones experimentales, mientras que los genes informadores duales proporcionan una base para el experimento mediante la transfección * * * "control", maximizando así Minimizar el impacto de factores externos como la actividad celular y la eficiencia de la transfección en el experimento, lo que hace que los resultados de los datos sean más creíbles.
Respuesta: El sistema de detección del gen indicador de luciferasa dual expresa simultáneamente luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla en las células. No tienen homología de fuente y corresponden a sustratos de reacción diferentes, por lo que no hay interferencia cruzada. Debido a la señal luminosa ultrafuerte y la relación señal-ruido ultraalta, este sistema se utiliza ampliamente para la verificación de genes diana de miARN. El miARN actúa principalmente sobre la 3'UTR del gen diana, y la región 3'UTR del gen diana se puede construir detrás del gen indicador luciferasa en el vector. Al comparar la sobreexpresión o interferencia del miARN, los cambios en la expresión del gen informador (monitoreo de cambios en la actividad de la luciferasa) pueden reflejar cuantitativamente el efecto inhibidor del miARN en los genes diana, es decir, el valor de fluorescencia se puede usar para determinar si el miARN se une al gen diana.
Respuesta: La longitud 3'UTR del gen objetivo es diferente, por lo que no es práctico insertar la longitud completa en el vector. Por lo general, solo se insertan alrededor de 200 pb de secuencia, incluido el sitio de unión de miARN, que son aproximadamente 400 pb [1], pero también hay documentos que insertan 80 pb [2], y también hay documentos que seleccionan más de 200 pb [3 ], pero estrictamente hablando, se deberían seleccionar 400 pb.
Respuesta: Hay dos estrategias comúnmente utilizadas por los operadores. La primera es que las dos luciferasas están ubicadas en dos transportadores respectivamente, y la segunda es que las dos luciferasas están ubicadas en el mismo transportador. Tomando el primero como ejemplo, estos dos vectores son el vector de miARN pMIR-REPORT y el vector pRL-TK. Después de la búsqueda, se descubrió que el vector de miARN pMIR-REPORT fue desarrollado por Ambion Company y se utiliza para clonar e insertar el vector de la secuencia objetivo de miARN y evaluar la función del miARN en las células. El mapeo de este vector es el siguiente:
Otro vector es el vector pRL-TK, desarrollado por Promega. pRL-TK es un vector indicador de la luciferasa de Renilla y contiene el potenciador SV40. El mapa del plásmido es el siguiente:
A partir de estos dos mapas, podemos encontrar que el vector pMIR-REPORT miRNA se utiliza principalmente para evaluar la unión del miRNA a la 3'UTR del gen diana The 3. La UTR del gen diana se sitúa detrás de la luciferasa, que es la luciferasa de luciérnaga, mientras que el vector pRL-TK expresa la luciferasa de Renilla. Cuando estos dos plásmidos * * * se cotransfectaron en 293 células para detectar fluorescencia, pRL-TK.
La segunda opción es construir luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla en vectores, de modo que la desviación sea menor. Después de todo, transfectar un plásmido es más fácil que transfectar dos plásmidos. En este sentido, según la información recuperada, el más famoso ahora es el plásmido pmirGLO de Promega Company. El mapa es el siguiente:
El otro plásmido es de producción nacional, que es el plásmido pEZX-MT06. del gen pluripotente. El mapa es el siguiente:
Respuesta: En primer lugar, debe saber que el plásmido insertado en la 3'UTR original del gen objetivo se denomina plásmido de tipo salvaje.
Además, necesitamos insertar un vector de secuencia con una mutación del sitio de unión de miARN en la 3'UTR de la luciferasa de luciérnaga. Este plásmido a menudo se denomina plásmido mutante. Finalmente, existen varios vectores de control, incluido el vector vacío de luciferasa de luciérnaga, el vector vacío de miARN y el vector de fluorescencia de renina. Como se muestra en el caso [4] en la literatura, este artículo utiliza.
Nota: pGL3 es el plásmido indicador de luciferasa, el verde es el grupo control, es decir, sin plásmido miARN, y el rojo es el grupo normal con plásmido miARN. La idea es que el plásmido de luciferasa (tres situaciones: ① plásmido vacío; ② plásmido con gen objetivo WT agregado 3'UTR; ③ plásmido con gen objetivo MUT 3'UTR) × situación de precursor de miARN (con o sin MUT)), la disposición se dividió en seis grupos, de la siguiente manera:
El primer grupo de plásmido de luciferasa pGL3 no agrega el fragmento 3'UTR del plásmido vector de miARN.
El segundo grupo de plásmido de luciferasa pGL3 no añade el fragmento 3’UTR del plásmido miR-200c.
El tercer grupo de plásmido de luciferasa pgl 3-WT-3'UTR miARN vector plásmido
El cuarto grupo se centra en el plásmido de luciferasa pgl 3-WT3'UTR miR-200 c.
El quinto grupo de plásmidos de luciferasa pgl 3-mut-3’UTR plásmido vector mirna.
El sexto grupo se centró en el plásmido de luciferasa pgl 3-mut-3’UTR mir-200 c.
Resultado ideal: El cuarto grupo disminuye, es decir, el miRNA puede unirse a la 3UTR del gen diana, mientras que el sexto grupo se mantiene sin cambios, es decir, la 3'UTR del gen diana no unirse al miARN después de la mutación.
Respuesta: El instrumento más clásico es el detector de luminiscencia GloMax 20/20 de Promega, pero este instrumento sólo es adecuado para probar un tipo de preparación a la vez. Pero también se puede detectar con un lector de microplacas multifunción (el instrumento de nuestro laboratorio es VARIOSKAN LUX), que puede lograr una detección de rendimiento múltiple. La luz producida por la luciferasa de luciérnaga es de color amarillo verdoso y tiene una longitud de onda de 550 a 570 nm; sin embargo, la luciferasa de Renilla produce luz azul con una longitud de onda de 480 nm.
Respuesta: Los resultados de la medición muestran que la señal de luz generada por la luciferasa de luciérnaga se registra como RL1 y la señal generada por la luciferasa de Renilla se registra como RL2. Después de que RL1/RL2 homogeneice los datos, se puede utilizar ANOVA para realizar pruebas entre cada dos grupos.