¿Qué experto puede decirme cuál es el papel de la proteinasa K en la purificación de productos de PCR y su principio? ¡Muchas gracias! ! ! ! ! !

Proteinasa K

La proteinasa K producida por el hongo Tritirachium album Limber es una serina proteasa con amplia actividad de escisión. Escinde los enlaces peptídicos carboxilo terminales de aminoácidos alifáticos y aromáticos y se utiliza para la degradación general de proteínas en muestras biológicas. Esta enzima se purifica para eliminar las actividades RNasa y DNasa. Debido a que la proteinasa K es estable en urea y SDS y tiene la capacidad de degradar proteínas nativas, se usa ampliamente, incluida la preparación de ADN cromosómico para electroforesis de pulso, transferencia Western y la eliminación de nucleasas en preparaciones de ADN y ARN. La concentración de trabajo general de proteinasa K es de 50 a 100 μg/ml.

Tampón de reacción recomendado: Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), CaCl2 10 mM.

La Proteasa K es una proteasa altamente activa de la clase de las subtilisinas, utilizada para la degradación general de proteínas en muestras biológicas. Purificado de Candida albicans (tritirachium album ágil). Según los datos, la enzima tiene dos sitios de unión de Ca2, que se encuentran a cierta distancia del centro activo de la enzima y no tienen relación directa con el mecanismo catalítico. Sin embargo, si se elimina Ca2 de la enzima, alrededor del 80% de la actividad catalítica se perderá debido a cambios estructurales remotos, pero la actividad restante suele ser suficiente para degradar proteínas que normalmente contaminan los productos ácidos. Por lo tanto, generalmente se agrega edta durante la digestión de la proteinasa K (para inhibir la acción de las nucleasas dependientes de mg2). Sin embargo, si desea digerir proteínas que son altamente resistentes a la proteinasa K, como la queratina, es posible que necesite utilizar un tampón que contenga 1 mmol/l de Ca2 sin EDTA. Después de la digestión y antes de la purificación del ácido nucleico, se debe añadir EGTA (ph8,0) hasta una concentración final de 2 mmol/l para quelar ca2.

La proteinasa K es una serina proteasa con amplia actividad de escisión. Escinde los enlaces peptídicos carboxilo terminales de aminoácidos alifáticos y aromáticos. Esta enzima se purifica para eliminar las actividades RNasa y DNasa. Debido a que la proteinasa K es estable en urea y SDS y tiene la capacidad de degradar proteínas nativas, se usa ampliamente, incluida la preparación de ADN cromosómico para electroforesis de pulso, transferencia Western y la eliminación de nucleasas en preparaciones de ADN y ARN. La concentración de trabajo general de proteinasa K es de 50 a 100 μg/ml. Activo en un amplio rango de pH (pH 4-12,5).

Tampón de reacción recomendado: Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), CaCl2 10 mM.

Patrón de preparación de Proteinasa K: 20mg/ml Patrón de preparación de Proteinasa K (proteinasa K): Añadir 200mg de proteinasa K a 9,5ml de agua, agitar suavemente hasta que la proteinasa K se disuelva por completo. No agite para mezclar. Añada agua hasta alcanzar un volumen de 10 ml, luego divídalo en porciones pequeñas y guárdelo a -20 °C.

El papel de la proteinasa K

Cabe señalar que la proteinasa K se utiliza habitualmente para el tratamiento de prehibridación en la tecnología de hibridación in situ. Tiene la función de digerir la proteína que rodea la proteína. ADN objetivo para aumentar la posibilidad de que la sonda se una al ácido nucleico objetivo y mejorar la señal de hibridación. Sin embargo, cuando la concentración de proteinasa K es demasiado alta, el tiempo de digestión es demasiado largo o la temperatura de incubación es demasiado alta, lo hará. Causa ciertos daños a la estructura celular, lo que resulta en el desprendimiento de secciones de tejido y los núcleos celulares desaparecen, lo que afecta los resultados de la hibridación. El tampón EDTA puede reemplazar el papel de la proteinasa K, resolver los problemas anteriores y lograr el efecto de tinción ideal. proteinasa K

Almacenamiento: Conservar en frigorífico a -20°C. Aquí se evita la congelación y descongelación repetidas, garantizando eficazmente 12 meses.

La temperatura de incubación es de 55 a 65°C, la temperatura de incubación ideal es de 58°C y el tiempo de incubación es de 15 minutos a 48 horas; el tiempo de incubación ideal es de 2 horas;

Ampliamente utilizada

La proteinasa K se ha utilizado ampliamente en cuero, pieles, seda, medicina, alimentos, elaboración de cerveza, etc. La depilación y ablandamiento de la industria del cuero ha hecho un uso extensivo de las proteasas, lo que no sólo ahorra tiempo, sino que también mejora las condiciones de higiene laboral. La proteasa también se puede utilizar para desgomar seda, ablandar carne y clarificar vino. Se puede utilizar clínicamente con fines medicinales, como el uso de pepsina para tratar la indigestión, el uso de proteasa ácida para tratar la bronquitis, el uso de elastasa para tratar la vasculitis y el uso de tripsina y quimotripsina para purificar heridas quirúrgicas purulentas y la serosa intertorácica. El detergente enzimático para ropa es un producto nuevo en detergentes. Contiene proteasa alcalina, que puede eliminar las manchas de sangre y la suciedad de proteínas en la ropa. Sin embargo, tenga cuidado de no entrar en contacto con la piel cuando lo use para evitar dañar las proteínas de la superficie de la piel y causar alergias. como erupciones y eccema.

Espero que esta información te pueda ser útil~