¿Se puede sonicar el tejido después de agregar trizol?
El reactivo de extracción de ARN total One Shine Typhoon es un reactivo que se puede utilizar para extraer ARN total de animales, plantas, microorganismos y virus. Tiene una gran capacidad para descifrar células o partículas de virus y puede descifrar las unidades básicas de diversas formas de vida en poco tiempo. Este producto contiene reactivos orgánicos que pueden inhibir eficazmente la RNasa y minimizar la degradación del ARN total. El ARN total extraído por este producto es de alta pureza y no contiene ADN genómico. Se puede utilizar directamente en diversos experimentos de biología molecular, como transferencia Northern, hibridación por transferencia puntual, purificación de ARNm, traducción in vitro, RT-PCR, selección poli(A)+, análisis de protección de ARNasa, construcción de bibliotecas de ADNc, etc.
Después de ser tratado con este producto, el líquido en el tubo de centrífuga se divide en tres capas: el ARN se encuentra en la fase acuosa superior, la fase sólida media y la fase orgánica inferior contienen ADN y proteína respectivamente. Por lo tanto, las capas media e inferior se pueden procesar profundamente para obtener ADN total y proteína total, la precipitación con etanol puede obtener ADN y la precipitación con alcohol isopropílico puede obtener proteínas.
Este producto es fácil de operar y todos los experimentos se pueden completar en una hora.
Métodos de transporte y almacenamiento
Transporte en bolsas de hielo a 4 ℃, almacene en la oscuridad y tiene una validez de un año. Debe sellarse durante el almacenamiento y no exponerse al aire durante mucho tiempo para evitar la oxidación y fallas del producto.
3. Precauciones
1. Este producto contiene reactivos tóxicos como fenol y β-mercaptoetanol, que son tóxicos y corrosivos. Se deben tomar medidas de protección durante el funcionamiento y colocarse en una campana extractora. No lo tome a la ligera. Si accidentalmente se toca la piel o las mucosas, trasladarse inmediatamente a un lugar ventilado y enjuagar con abundante agua del grifo. Busque atención médica de inmediato cuando sea necesario.
2. Cloroformo, alcohol isopropílico, etanol al 75%, agua tratada con DEPC, etc. (proporcionado por nuestra empresa) es obligatorio. Todas las puntas, tubos de centrífuga, tubos de PCR, recipientes de vidrio, etc. Solo se puede usar después del tratamiento con agua DEPC o horneado a alta temperatura para evitar que la RNasa degrade el ARN total (disponible en nuestra empresa).
3. Después de homogeneizar la muestra con el reactivo de extracción de ARN total, si no se agrega cloroformo para los experimentos posteriores, se puede almacenar a -70 °C durante más de un mes. Se recomienda realizar experimentos posteriores lo antes posible después de extraer el ARN total. El almacenamiento a corto plazo debe almacenarse a -70 °C y solo puede congelarse y descongelarse una vez.
4. Un volumen de muestra excesivo puede provocar una pirólisis insuficiente, reducir la pureza del producto y provocar contaminación. Al aspirar el sobrenadante, no desees más ni tengas prisa. El nivel de líquido del sobrenadante que queda después de la adsorción debe estar al menos a 2 mm de la capa media para evitar la contaminación del ADN causada por la adsorción a la capa media y falsos positivos en experimentos posteriores.
5. Proceso de operación
Extracción de ARN
Preparación de reactivos
Cloroformo, alcohol isopropílico, etanol al 75% y ácido ribonucleico -enzima libre en agua o SDS al 0,5% (todas las soluciones deben prepararse con agua tratada con DEPC).
Procedimientos operativos
1. Tratamiento de homogeneización
a. Tejido: triturar el tejido en nitrógeno líquido y añadir 1 ml de Thai por cada 50-100 mg. de tejido. Se homogeneizan con un homogeneizador los tejidos blandos como el hígado y el cerebro. Luego agregue 1 ml de Typhon y sople suavemente repetidamente hasta que la solución no gire. El volumen de la muestra no debe exceder el 10% del volumen de Typhon.
B. Cultivo en monocapa celular: Retire el medio de cultivo celular, enjuague una vez con PBS, agregue Typhon directamente a la placa de cultivo para lisar las células, agregue 1 ml por área de 250 px2, pipetee varias veces y transfiera a 1,5 ml. Tubo de centrífuga, soplar repetidamente hasta que la solución no gire. La dosis de Typhi debe determinarse en función del área de la placa de cultivo. Una adición insuficiente de Typhon puede provocar contaminación del ADN en el ARN extraído.
c.Suspensión celular: Recoger las células por centrifugación. Por cada 5-10×106 células animales, vegetales, de levadura o 1×107 células bacterianas, añadir 1 ml de tripsina y pipetear repetidamente hasta obtener la solución. ya no gira. No lave las células antes de agregar Typhon para evitar la degradación del ARNm. Algunas levaduras y células bacterianas requieren homogeneización.
2. Colocar la muestra homogeneizada a temperatura ambiente (15-30°C) durante 5 minutos para separar completamente los complejos ácido nucleico-proteína.
3. Paso opcional: Si la muestra contiene más proteínas, grasas, polisacáridos o sustancias extracelulares (músculo, nódulos de raíces de plantas, etc.).
), centrifugar a 12.000 × g durante 10 minutos a 2-8°C y tomar el sobrenadante. El sedimento obtenido por centrifugación contiene membranas extracelulares, polisacáridos y ADN de alto peso molecular, y el sobrenadante contiene ARN. Al procesar tejido adiposo, se debe eliminar una gran cantidad de la capa superior de grasa y utilizar el homogeneizado clarificado para la siguiente operación.
4. El primer paso: añadir 0,2 ml de cloroformo por cada 1 ml de cantaris, agitar suavemente o soplar durante 15 segundos y dejar reposar a temperatura ambiente durante 3 minutos.
5. Centrifugar a 12000×g durante 15 minutos a 2-8°C. La muestra se divide en tres capas: la capa inferior es una fase orgánica amarilla, la capa superior es una fase acuosa incolora o ligeramente amarilla y la capa intermedia es una fase sólida. El ARN se encuentra principalmente en la fase acuosa y el volumen de la fase acuosa es aproximadamente el 60% del reactivo de enriquecimiento utilizado.
6. Transfiera la fase acuosa a un tubo de ensayo nuevo (si desea separar ADN y proteínas, puede conservar la fase orgánica) y utilice alcohol isopropílico para precipitar el ARN en la fase acuosa. Por cada 1 ml de Typhon añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico y dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
7. Centrifugar a 10000×g durante 10 minutos a 2-8°C. No se observó precipitación de ARN antes de la centrifugación, pero apareció precipitación coloidal en la pared y el fondo del tubo después de la centrifugación. Retire el sobrenadante.
8. Lavar el sedimento de ARN con etanol al 75%. Por cada uso de 1 ml de espadaña se debe añadir al menos 1 ml de etanol al 75%. Centrifugar a 2-8°C y no más de 7500 × g durante 5 minutos y desechar el sobrenadante.
9. Dejar secar a temperatura ambiente o secar al vacío el pellet de ARN. No dejes que se seque demasiado, de lo contrario no se disolverá fácilmente. Déjalo secar durante unos 5 a 10 minutos. Agregue 25-200 μl de agua libre de RNasa o SDS al 0,5 % (disponible en nuestra empresa), aspire varias veces con una pistola y deje reposar a 55-60 °C durante 10 minutos para disolver el ARN. Si se utiliza ARN para reacciones de digestión enzimática, no utilice solución SDS. El ARN también se puede solubilizar en formamida 100 % desionizada. Conservar a -70°C.
Precauciones en la extracción de ARN
1. Al extraer ARN de un pequeño número de muestras (1-10 mg de tejido o 102-104 células), se puede añadir un poco de glucógeno para promover el ARN. precipitación. Por ejemplo, agregue 800 l de muestra homogeneizada de fiebre tifoidea, centrifugue el sobrenadante y agregue 5-10 μg de glucógeno libre de RNasa antes de la precipitación del ARN con isopropanol. El glucógeno precipitará junto con el ARN. Una concentración de glucógeno no superior a 4 mg/ml no afectará la síntesis de la primera cadena ni afectará la reacción de PCR.
2. Añadir Typhon después de la homogeneización. La muestra se puede almacenar a -60 - 70°C durante al menos un mes antes de añadir cloroformo. Los precipitados de ARN se pueden almacenar en alcohol al 75 % a 2-8°C durante más de una semana, o a -5-20°C durante más de un año.
3. También se puede utilizar una centrífuga de escritorio de baja velocidad para la estratificación y la precipitación del ARN. Centrifugar a 2600 × g durante 30-60 minutos.
Análisis de problemas comunes en la extracción de ARN
Bajo rendimiento:
A. Procesamiento de homogeneización o craqueo de muestras incompleto
B. el precipitado no está completamente disuelto
a260/A280 <1.65:
A. Al detectar absorbancia, la muestra de ARN no es soluble en agua, pero sí en TE. Los valores de A280 son más altos a concentraciones bajas de iones y valores de pH bajos.
b. Cuando la muestra se homogeneiza, se añade muy poco reactivo.
C. Homogeneizar la muestra tras reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
D. Cuando se absorbe la fase acuosa, se mezcla la fase orgánica.
E. El sedimento de ARN no está completamente disuelto.
Degradación del ARN:
A. El tejido no fue procesado ni congelado inmediatamente después de su extracción.
b.Las muestras a extraer de ARN no se almacenan en un ambiente de -60 a -70°C, sino en un ambiente de -5 a -20°C.
C. Sobretratar las células con tripsina.
D.RNase no elimina soluciones ni tubos de centrífuga.
E. El valor de pH del formaldehído utilizado para la electroforesis es inferior a 3,5.
Contaminación del ADN:
A. Al homogeneizar la muestra se añade muy poco reactivo.
b. La muestra contiene disolventes orgánicos (como etanol, DMSO, etc.), tampones fuertes o soluciones alcalinas.
Contaminación por proteoglicanos y polisacáridos:
Durante el proceso de precipitación del ARN, estas contaminaciones se pueden eliminar mediante las siguientes mejoras.
En el paso 7, por cada 1 ml de tripolifosfato de sodio utilizado, agregue 0,25 ml de alcohol isopropílico y 0,25 ml de solución con alto contenido de sal (citrato de sodio 0,8 M y 1,2 ml de cloruro de sodio) a la fase acuosa y proceda como antes. Centrifugue la mezcla. . Este método retiene proteoglicanos y polisacáridos en solución y precipita eficazmente el ARN puro. Al extraer ARN de plantas que contienen una gran cantidad de polisacáridos, es necesario homogeneizar y centrifugar, y añadir los pasos anteriores.
Aislamiento de ADN
Preparar reactivos
Etanol, citrato de sodio 0,1 M (que contiene etanol al 10%), etanol al 75% y NaOH 8 mM.
Procedimientos operativos
1. Después de cubrir la muestra con cloroformo, retire la fase acuosa superior y use etanol para precipitar el ADN en la capa intermedia y la fase orgánica. Utilice 1 ml de Typhon cada vez, agregue 0,3 ml de etanol absoluto, mezcle, déjelo a temperatura ambiente durante 3 minutos y centrifugue a 2-8 °C durante no más de 2000 xg durante 5 minutos.
2. Retire el sobrenadante y (consérvelo si se requiere separación de proteínas; consulte más adelante para operaciones adicionales) lave el sedimento de ADN con citrato de sodio 0,1 M que contenga etanol al 10 %. Agregar 1 ml de citrato de sodio por cada 1 ml de cantaris, dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos, centrifugar a 2-8°C durante 5 minutos, desechar el sobrenadante y repetir.
3. Lavar nuevamente el sedimento de ADN con etanol al 75%. Por cada 1 ml de Typhoon utilizado, añadir 1,5-2 ml de etanol al 75%, dejarlo a temperatura ambiente durante 10-20 minutos (invertir ocasionalmente). ), y centrifugar a 2-8°C durante 2000 ×g durante 5 minutos, desechar el sobrenadante.
4. Dejar secar el ADN a temperatura ambiente durante 5-15 minutos y disolver el ADN con NaOH 8mM. El ADN aislado de 50 a 70 mg de tejido o 10 células se disuelve en 300 a 600 μl de NaOH 8 mM. La concentración de ADN suele ser de 0,2 a 0,3 μg/μl. Se recomienda que el precipitado de ADN extraído no sea fácilmente soluble en agua. Utilice disueltos alcalinos débiles, el valor de pH de NaOH 8 mM es 9. Después de disolver el ADN, el pH se puede ajustar con TE y HEPES. El ADN extraído de algunas muestras (especialmente tejidos) puede contener algo de materia coloidal insoluble, que puede eliminarse mediante centrifugación a >:12000 xg durante 10 minutos.
Cuantificación de ADN
Disolver una porción de ADN en NaOH 8mM, añadir agua y medir el valor de A260. Una unidad de A260 equivale a 50 μg/ml de ADN bicatenario. Teóricamente, el contenido de ADN de 1 x 106 células diploides de ser humano, rata y ratón es de aproximadamente 7,1 µg, 6,5 µg y 5,8 µg respectivamente.
Aplicación del aislamiento de ADN
1. Utilice 0,1 mepes para ajustar el pH del ADN disuelto en NaOH 8 mM para PCR a 8,4 y utilice 0,1-1 μg de ADN como plantilla de PCR.
2. Utilice HEPES o 1 medta para ajustar el pH al valor adecuado. Utilice de 3 a 5 unidades de enzima por μg de ADN, y la dosis de enzima es de 3 a 5 IV/mg de ADN.
Precauciones en el aislamiento de ADN
1. Cuando el ADN se encuentra en la capa media y en fase orgánica, se puede almacenar durante la noche a 2-8°C.
2. El precipitado de ADN se puede almacenar en etanol al 75% a 2-8 ℃ durante varios meses.
3.El ADN se puede almacenar en una solución de NaOH 8 mM a 4 °C durante la noche. Para almacenamiento a largo plazo, use HEPES para ajustar el pH a 7-8, agregue EDTA a 65438 ± 0 mm y almacene a 4 °C o -20 °C.
Análisis de problemas comunes en el aislamiento de ADN
Bajo rendimiento
A. Homogeneización y craqueo incompleto de las muestras
B. El pellet obtenido no se disolvió completamente.
a260/A280 <1.70
A. Al detectar absorbancia, la muestra de ARN no es soluble en agua, pero sí en te.
B. Si el fenol no se elimina por completo, el sedimento de ADN se puede lavar nuevamente con citrato de sodio 0,1 M (que contiene etanol al 10%).
Degradación del ADN
A. El tejido no fue procesado ni congelado inmediatamente después de su extracción.
b. Las muestras a extraer del ARN no se almacenan en un ambiente de -60 a -70 ℃, sino en un ambiente de -5 a -20 ℃.
C. Utilizar un homogeneizador de alta velocidad para homogeneizar la muestra.
Contaminación por ARN
A. Después de la aplicación de capas de cloroformo, la fase acuosa no se eliminó por completo.
B. La precipitación del ADN no se eluye completamente con citrato de sodio 0,1 M (que contiene etanol al 10 %).
Separación de proteínas
Preparar reactivos
Alcohol isopropílico, etanol al 95% que contiene clorhidrato de guanidina 0,3 M, etanol absoluto y SDS al 1%.
Procedimientos operativos
1. Tome el sobrenadante restante después de la precipitación del ADN y use alcohol isopropílico para precipitar la proteína. Utilice 1 ml de typon cada vez, agregue 1,5 ml de alcohol isopropílico, déjelo a temperatura ambiente durante 10 minutos, centrifugue a 12 x g durante 10 minutos a 2-8 °C y deseche el sobrenadante.
2. Lavar el sedimento de proteínas con etanol al 95% que contenga clorhidrato de guanidina 0,3 M. Utilice 1 ml de Typhon cada vez, agregue 2 ml de solución de lavado, colóquelo a temperatura ambiente durante 20 minutos, centrifugue a 7500 xg durante 5 minutos a 2-8 °C, deseche el sobrenadante y repita dos veces. Lavar nuevamente de la misma manera con 2 ml de etanol absoluto.
3. Drene al vacío el precipitado de proteína durante 5-10 minutos, disuelva la proteína con SDS al 1%, absorba repetidamente, báñelo en agua a 50 ℃ hasta que se disuelva por completo, centrifugue a 10000 × g durante 10 minutos a 2ºC. -8 ℃ y eliminar la materia insoluble. Las muestras de proteínas aisladas se pueden utilizar para Westernblot o almacenarse entre -5 y 20 °C.
Notas sobre la extracción de proteínas
1. La proteína se precipita en etanol al 95% o etanol absoluto que contiene clorhidrato de guanidina 0,3 M y se puede almacenar durante más de un mes a 2-8 °C. C., se puede almacenar durante más de un año a -5-20 ℃.
2. Dializar tres veces con SDS al 0,1 % a 2-8 °C, centrifugar a 10000 xg durante 10 minutos y tomar el sobrenadante para Western blot.
Análisis de problemas comunes en la extracción de proteínas
Bajo rendimiento:
A. Cracking u homogeneización incompleta de la muestra
B .La proteína resultante El pellet no está completamente disuelto.
Degradación de proteínas:
El tejido no fue procesado ni congelado inmediatamente después de su extracción.
Deformación de la banda durante la electroforesis:
Lavado insuficiente de la precipitación de proteínas.