¿Adquisición de semillas de maíz transgénicas mediada por Agrobacterium?

1.1 Trigo transgénico obtenido mediante el método de pistola genética 1992 fue un año histórico para el uso de la biotecnología moderna para mejorar el trigo. Vasil et al. utilizaron callos embriogénicos cultivados a largo plazo como explantes e introdujeron el gen GUS/Bar en la variedad de trigo "Pavon" a través de una pistola genética para obtener plantas regeneradas (T0) y plantas posteriores (T1) que son resistentes al herbicida. Basta. ), anunciando así la llegada de la primera variedad de trigo genéticamente modificada del mundo. Un año después, el mismo grupo de investigación optimizó el método genético, utilizando embriones inmaduros y sus callos como explantes, y logró tres genotipos de trigo (Pavon, Bobwhite y RH770019), y obtendrá transgenes. El tiempo de vida de las plantas de trigo se acorta de 15 meses a 7-9 meses. En este año, Weeks et al. también informaron que se obtuvieron plantas de trigo transgénico mediante bombardeo genético utilizando embriones inmaduros de la variedad "Bobwhite" como explantes. Dos laboratorios independientes obtuvieron resultados iguales o similares (obtención de plantas transgénicas) utilizando el mismo tejido (embriones inmaduros) de la misma variedad (Bobwhite) y el mismo método (biolística), lo que indica que el método transgénico utilizado es confiable. Desde entonces, ha habido cada vez más informes sobre la obtención de trigo transgénico mediante métodos biolísticos utilizando embriones inmaduros (o “embriones jóvenes”) y sus derivados como explantes, y hasta ahora se ha convertido en el principal método de transducción de genes del trigo. Vale la pena mencionar que, al apuntar al meristemo apical del embrión de trigo, al meristemo apical vegetativo y al meristemo de la inflorescencia, la pistola genética "de mano" también se puede utilizar para obtener expresión transitoria de genes extraños y plantas transgénicas. Este método puede evitar el problema del número de células totipotentes y tiene cierto potencial en la transducción de genes del trigo.

1.2 Trigo transgénico obtenido por el método de paso del tubo polínico. El trabajo sobre la transducción del trigo mediante el método de paso del tubo polínico se concentró principalmente en los primeros cinco años (1990-1995), y principalmente en mi país. Zhou Wenlin y otros informaron que el ADN de los cultivos C4 se introdujo en el trigo de primavera a través de tubos polínicos, y se obtuvo trigo transgénico y su descendencia con varios rasgos C4. Cheng Zhuomin y otros informaron que habían obtenido trigo transgénico con el gen CP del virus del enanismo amarillo del trigo y Zeng Junzhi y Liu Genqi et al. Desafortunadamente, estos informes en ese momento carecían de evidencia biológica molecular de la integración y expresión de genes extraños (o ADN) en plantas de trigo transgénicas y su progenie. Recientemente, Zeng y Wu et al realizaron un análisis de la expresión de "genes" exógenos en la progenie de trigo transgénico obtenido mediante el método de paso del tubo polínico entre 1990 y 1994, incluido el análisis mediante métodos de biología molecular, demostrando que la integración de genes exógenos y expresión, demostrando así que se puede obtener trigo transgénico mediante el método de paso del tubo polínico. Zhou Wenlin, Ni Jianfu et al. (comunicación personal) utilizaron el gen quimérico eMS/Bar que construimos para transducir trigo y obtuvieron plantas con resistencia a herbicidas y rasgos de esterilidad masculina, y su descendencia aún mostró resistencia a los herbicidas. El método de paso del tubo polínico evita los complejos procesos de cultivo de tejidos y regeneración de plantas, y es un método de transducción de genes prometedor en el trigo.

1.3 Trigo transgénico obtenido por otros métodos directos Otros métodos directos, como la microinyección, la punción con microhaz láser, la estimulación eléctrica y mediada por PEG, son casi ineficaces en la transformación del trigo. Aunque numerosos estudios han demostrado que los genes exógenos pueden expresarse transitoriamente en protoplastos y células tratadas con estos métodos directos e incluso expresarse de manera estable en el callo producido, sólo existe un informe sobre la obtención de una planta de trigo transgénica. He et al. utilizaron protoplastos del cultivar "Hartog" como receptores y obtuvieron plantas transgénicas verdes con resistencia a herbicidas (PPT) mediante el método de descarga eléctrica, pero estas plantas no lograron producir semillas. La dificultad en la regeneración de los protoplastos del trigo o de las plantas unicelulares puede ser la principal razón del fracaso de métodos directos como la electroexcitación, el PEG y la microinyección en transgénicos de trigo. Precisamente debido a estas dificultades, las perspectivas de métodos directos que utilicen protoplastos o células individuales como receptores en la transducción de genes del trigo se han vuelto muy sombrías.

1.4 Trigo transgénico obtenido mediante el método mediado por Agrobacterium Desde la aparición de la primera planta transgénica mediada por Agrobacterium tumefaciens en 1983, el método mediado por Agrobacterium se ha convertido rápidamente en el método gemelo líder para la transducción de genes en plantas de hoja. Este método es fácil de operar, tiene bajo costo, alta eficiencia de transformación, alta tasa de integración de genes de copia única y el gen extraño es relativamente estable en la descendencia de plantas transgénicas. La posibilidad de introducir este método en la transducción genética de plantas monocotiledóneas, incluido el trigo, se convirtió en un tema candente de discusión e investigación alrededor de la década de 1990. En ese momento, la tendencia era que las monocotiledóneas no fueran huéspedes naturales de Agrobacterium, y era casi imposible o imposible utilizar Agrobacterium para transformar monocotiledóneas. La figura representativa de esta visión es Potrykus, un científico suizo que ha logrado logros sobresalientes en el cultivo de tejidos y la transducción genética del trigo y otros cultivos de cereales. Publicó su pesimismo en las prestigiosas revistas internacionales "Bio/Technology" y "Nature". . La adquisición de plantas transgénicas mediadas por Agrobacterium, especialmente arroz y maíz transgénicos mediados por Agrobacterium, no solo cambió la opinión de que las monocotiledóneas no son el huésped natural de Agrobacterium, sino que también demostró que el método mediado por Agrobacterium puede usarse para la transformación genética. de cultivos de cereales.

En el trigo, aunque algunas personas demostraron que Agrobacterium puede infectar y transformar genéticamente ya en 1988, otros demostraron más tarde que Agrobacterium puede adherirse a células de trigo parcialmente digeridas enzimáticamente y no enzimáticamente digeridas, pero ninguna planta transgénica lo ha hecho. se ha obtenido durante muchos años. Hess et al. informaron que inocularon directamente Agrobacterium en espiguillas para obtener plantas contemporáneas transgénicas con resistencia a los antibióticos y probada mediante hibridación Southern Blot. Sin embargo, no se detectó la presencia de genes extraños en F1 y F2. Después de la polinización artificial, los pistilos se trataron con Agrobacterium (cepa C158) que porta el vector híbrido (pCV2260 y pSIR42). Pukhal'skii obtuvo plantas F1 probadas mediante PCR y hibridación Southern Blot, y así obtuvo plantas F1 con apariencia externa de plantas F2. genes fuente. Este sencillo método de transformación genética combina las ventajas del paso del polen y la infección por Agrobacterium. Si puede ser confirmado por otros laboratorios, desempeñará un papel destacado en la transformación genética del trigo y otras enfermedades.

En términos de transducción de genes de trigo mediada por Agrobacterium, Cheng et al. rompieron más de diez años de silencio en 1997 y obtuvieron la primera planta de trigo transgénica normal. Dos años más tarde, el científico chino Xia Guangmin y otros informaron sobre la adquisición de plantas de trigo transgénicas mediadas por Agrobacterium. El grupo de investigación del autor también obtuvo con éxito plantas de trigo transgénicas mediadas por Agrobacterium (por publicar). Este éxito significa que el trigo también puede disfrutar de todas las ventajas de la transformación genética mediada por Agrobacterium, como las dicotiledóneas.

El método "Agrolístico", que combina métodos mediados por Agrobacterium y métodos de pistola genética, puede ayudar a la unión de Agrobacterium y a la transferencia de los plásmidos contenidos en él a las células receptoras a través de los microporos creados por microproyectiles, o puede transportar tres plásmidos que contienen VirD1, VirD2 y secuencias fronterizas de ADN-T más fragmentos exógenos. A través de la expresión normal de VirD1 y VirD2 en el receptor, el fragmento diana exógeno adopta la secuencia fronteriza de ADN-T en un nivel inferior. copia. Varias inserciones en el genoma del receptor ya han dejado su huella en la transformación genética del trigo. La transformación mediada por Agrobacterium asistida por ultrasonido (SAAT) utiliza microporos generados por ultrasonido en las células receptoras para ayudar a Agrobacterium a adherirse y transferir los plásmidos que contiene a las células receptoras, permitiendo que fuentes extrañas La intensidad de expresión transitoria del gen en las células receptoras del trigo es aumentado al menos 100 veces en comparación con el método puro de Agrobacterium. Singh, Chawla y Serik también utilizaron fibras de carburo de silicio para ayudar a los transgenes de Agrobacterium. Además, también existen métodos de "agroinfección" que combinan Agrobacterium y virus.

Aunque estos métodos aún están inmaduros, tienen un gran potencial en la transducción de genes del trigo.

2. Receptor de transformación genética en trigo

Como receptor de transformación genética, depende del método transgénico utilizado, y la dificultad de operar el receptor determina el éxito o fracaso del mismo. El método transgénico.

Las células embrionarias de trigo en suspensión y sus protoplastos aislados se utilizan a menudo como receptores de métodos transgénicos directos como la electroexcitación, el PEG y la microinyección. Precisamente debido a la dificultad de regenerar plantas a partir de protoplastos y células en suspensión, los métodos directos como los de electroexcitación tienen poca “utilidad” en la transformación genética del trigo. El callo embriogénico del trigo, especialmente el embrión inmaduro y su callo y el escutelo del embrión inmaduro y su callo, tienen una fuerte capacidad de regeneración vegetal (algunos piensan que tienen una mayor proporción de células totipotentes), independientemente de su papel como receptor de el método biolístico y el método mediado por Agrobacterium pueden regenerar plantas transgénicas, convirtiéndose así en el principal receptor para la transformación genética del trigo hasta ahora. Al mismo tiempo, el método biolístico se ha convertido en el principal método transgénico del trigo en la actualidad, y también es posible. utilizar el método mediado por Agrobacterium se convertirá en el principal método para la transformación genética del trigo en el futuro. Los resultados experimentales del grupo de investigación del autor en los últimos años (que se publicarán) muestran que el callo de las anteras del trigo tiene una gran capacidad de regeneración y es relativamente fácil obtener plantas transgénicas después del bombardeo con una pistola genética, por lo que también es un buen receptor. de transgenes de trigo. Varios meristemas del trigo tienen un gran potencial como receptores de armas genéticas "portátiles", pero la realización de este potencial aún espera la mejora y la disponibilidad económica de las propias armas genéticas. El pistilo, como único receptor para el método de paso del tubo polínico y el método de paso del polen de Agrobacterium, desempeñará un papel cada vez más importante en los transgénicos de trigo con la mejora de estos métodos transgénicos, y puede desempeñar un papel de liderazgo. Las microsporas, el polen, las megasporas y las bases de las hojas pueden desarrollarse aún más como receptores de transgenes del trigo, pero es poco probable que se conviertan en receptores importantes en un futuro próximo. Las mazorcas jóvenes pueden ser un buen receptor para la transformación genética en el trigo. Chen Lianghong observó en un experimento de transformación que comparaba espigas jóvenes y embriones jóvenes como receptores que el efecto de transformación de las espigas jóvenes era mejor que el de los embriones jóvenes.

3. Genes diana y selección de la transformación de genes del trigo

Genes marcadores Hasta ahora, los genes de selección y los genes indicadores comúnmente utilizados en la transformación de genes de plantas dicotiledóneas todavía se utilizan principalmente como transformación genética del trigo. Los genes diana y los genes de selección incluyen principalmente los genes indicadores GUS, CAT y LUC; resistencia a antibióticos NptII, Hpt y resistencia a herbicidas Bar, EPSP, Bxn, CP4 y GOX. El objetivo principal de utilizar estos genes en el trigo es establecer un sistema de transformación genética eficaz. Con el establecimiento y mejora de los sistemas de transformación genética del trigo, está aumentando el uso de genes objetivo reales destinados a mejorar las características del trigo. Hasta ahora, los genes diana que se han introducido en el trigo y se han expresado en plantas transgénicas incluyen principalmente: ① genes para mejorar la calidad del procesamiento del trigo: genes lAxl, lDx5 y lDxl0 de la subunidad de glutenina de alto peso molecular (subunidad de glutenina HMW) y glutelina recombinante de alto peso molecular. genes de subunidades Genes de subunidades de proteínas. ②Genes de resistencia a enfermedades: genes de la proteína de la cubierta del virus (CP), genes de las proteínas similares a la germinal (GLP), genes de la proteína similar a la taumatina del arroz TLP, genes de veratrol sintasa (estilbeno sintasa), gen de la proteína inactivadora de ribosa (RIP) de la semilla de cebada y D del maíz transposón; ③ genes quiméricos de esterilidad masculina: gen de ribonucleasa Barnasa, genes de proteínas citoesqueléticas, etc. ④ genes de resistencia a herbicidas: Bar, EPSP, Bxn, CP4 y GOX.

Los genes de resistencia a los antibióticos, como NptII y Hpt, que se utilizan ampliamente como genes de selección en plantas dicotiledóneas, rara vez se utilizan en los transgénicos de trigo. Hay dos razones principales: en primer lugar, el trigo tiene una alta resistencia natural al Kan y, en segundo lugar, la gente está preocupada por la seguridad de los genes antibióticos contenidos en el trigo.

Hasta ahora, el gen de selección más utilizado en el trigo genéticamente modificado es el gen de resistencia a herbicidas Bar.

Los genes informadores GUS, CAT y LUC han realizado contribuciones significativas al establecimiento de sistemas de transformación de genes del trigo. Pero hoy en día, cuando el sistema transgénico del trigo está básicamente maduro, la gente ha comenzado a buscar otros genes para reemplazar los genes indicadores simples antes mencionados o ya no utilizar genes indicadores en absoluto. Cabe mencionar la aparición de genes reporteros visibles (marcadores visuales). McCormac et al. y Mentewab et al. utilizaron genes estimuladores de la biosíntesis de antocianinas, como Cl/Lc, como genes indicadores para seleccionar transformantes en función del color de los receptores transformados y sus células. Este es un gen informador con un amplio valor de aplicación. Además, el gen sintético de la proteína fluorescente verde (SGFP-S65T) también se ha utilizado para informar la transformación genética en el trigo.

4. Expresión y análisis de expresión de genes extraños en trigo transgénico

CaMV 35s, un promotor ampliamente utilizado para expresar constitutivamente genes extraños en plantas transgénicas, se utiliza en cereales. El efecto es débil. . Para mejorar la expresión de genes extraños en el trigo transgénico, las personas usan secuencias dobles de CaMV35, agregan inserciones de genes monocotiledóneas (como el inserto del gen Adhl del maíz) o cambian al uso de promotores de genes monocotiledóneas. promotor del gen Actl del arroz y promotor del gen Ubil del maíz. Los promotores Actl y Ubil son actualmente los promotores constitutivos más utilizados en los transgénicos de trigo. Además, el promotor constitutivo artificialmente recombinante pEmuGN promueve la intensidad de expresión de genes extraños en trigo transgénico, etc., que es al menos 10 veces mayor que la de CaMV35. Este tipo de promotor recombinante será de gran utilidad en la transformación genética del trigo.

La aplicación de promotores de expresión específicos de tejidos y/u órganos supone un gran avance en los transgénicos de trigo. De particular interés es la utilización de promotores específicos del polen de anteras. De Block et al. utilizaron el promotor ca específico del tapetum de anteras de arroz para impulsar la expresión del gen de la ribonucleasa Barnse en trigo transgénico, creando así el primer trigo masculino estéril genéticamente modificado del mundo. El grupo de investigación del autor también creó trigo masculino estéril modificado genéticamente utilizando el promotor TA29 específico del tapetum de las anteras del tabaco. La mejora y combinación del trigo masculino estéril modificado genéticamente cambiará por completo la difícil situación actual de la producción de semillas de trigo híbrido. Además, los promotores químicamente inducibles también tienen un gran potencial de aplicación en el trigo transgénico.

En los últimos años se han realizado algunas investigaciones sobre la integración y expresión de genes extraños en el trigo transgénico, incluida la investigación molecular. En general, se cree que el método de integración de genes extraños en el trigo transgénico está relacionado con el método transgénico utilizado, pero ya sea un arma genética o un método mediado por Agrobacterium, la copia baja y la integración simple siguen siendo los métodos de integración dominantes; genes La herencia es mendeliana en la mayoría de los descendientes de líneas transgénicas. Los experimentos de Bieri et al. demostraron que el gen objetivo (RIP) asociado con las MAR (regiones asociadas a la matriz) todavía era muy estable en las últimas cuatro generaciones de trigo transgénico. Sin embargo, Álvarez et al. Las plantas perdieron el gen extraño integrado en la generación T2. Según Uze et al., los genes extraños se pueden integrar en el genoma del trigo independientemente de si son monocatenarios o bicatenarios, lineales o circulares, pero los genes lineales tienen una mayor eficiencia de transformación. Zupan et al. observaron que la proteína Agrobacterium VirE2 puede coordinar la captación nuclear de ADN monocatenario en células vegetales transgénicas. Srivastava et al. informaron sobre el método de "recombinación de sitio específico", que utilizaron para convertir con éxito cuatro sitios de genes de inserción de 4 copias en genes de una sola copia.

Además, Pederson et al. también utilizaron la hibridación fluorescente in situ (FlSH) para estudiar la ubicación de genes introducidos mediante método biolístico en los cromosomas del trigo transgénico.

Observaron que diferentes líneas transgénicas de la misma variedad (Florida) tienen diferentes sitios de inserción de genes extraños. Por ejemplo, el punto de inserción de una cepa está en el cromosoma 6B, mientras que el punto de inserción de otra cepa está en el cromosoma 2A. Un estudio en profundidad de este tipo ayudará a comprender el "efecto de posición" del gen insertado, lo que permitirá comprender mejor la expresión y estabilidad de genes extraños en el trigo transgénico.

5. Principales problemas en la transformación genética del trigo

Aunque la investigación sobre el trigo transgénico ha avanzado rápidamente en los últimos años, en comparación con las dicotiledóneas e incluso con el arroz, que también es un cereal, respecto al arroz. maíz, todavía hay una gran brecha. La brecha más obvia es que más de 120 variedades de docenas de cultivos dicotiledóneos genéticamente modificados se han utilizado en la práctica de producción o han sido aprobadas para pruebas de campo. También se han utilizado en la práctica de producción varias variedades de arroz y maíz genéticamente modificados. todavía en la etapa de establecimiento y optimización de su sistema genéticamente modificado. El autor cree que las principales razones de esta diferencia pueden ser los siguientes problemas en la modificación genética del trigo:

El primero, y más importante, es el problema técnico del cultivo de tejidos del trigo. La baja tasa de regeneración de las plantas y la fuerte dependencia del genotipo en el cultivo de tejidos de trigo son obstáculos que limitan el éxito de los transgénicos y aumentan significativamente la cantidad de trigo transgénico. Para las variedades de trigo con una fuerte regeneración de plantas, como Bobwhite, las plantas transgénicas se han obtenido utilizando el método Gene Gun o Agrobacterium, mientras que para las variedades con poca regeneración, las plantas transgénicas no se pueden obtener utilizando Gene Gun. Precisamente debido al problema de la regeneración de variedades, el trigo genéticamente modificado del mundo se concentra en unos pocos genotipos, y estos genotipos no son necesarios en la práctica de producción o tienen aplicaciones muy limitadas en la práctica de producción.

En segundo lugar, el receptor para la transformación genética es relativamente único. Los embriones inmaduros y sus derivados son los receptores dominantes de los transgenes de trigo. Sin embargo, en los países en desarrollo de todo el mundo, muy pocas personas pueden proporcionar embriones inmaduros de trigo.

En tercer lugar, la excesiva dependencia de la artillería genética de las nutrias. En la actualidad, más del 90% del trigo modificado genéticamente se obtiene mediante el método de pistola genética, y las deficiencias del método de pistola genética han sido muy evidentes en las plantas dicotiledóneas, por lo que no es necesario dar más detalles aquí. De hecho, estas dos razones son causadas esencialmente por la primera razón. Además, el alto precio de las armas genéticas también es un factor incidental.

En cuarto lugar, falta una investigación sistemática y profunda sobre el mecanismo de transformación de Agrobacterium en plantas monocotiledóneas, especialmente el trigo. En la actualidad, la gente se ha dado cuenta de que diferentes tipos de Agrobacterium tienen diferentes capacidades infectivas en las mismas plantas monocotiledóneas, e incluso las capacidades infectivas de la misma cepa en diferentes condiciones de cultivo son significativamente diferentes. Algunas plantas monocotiledóneas, incluido el trigo, también tienen algunos factores que no favorecen la infección por Agrobacterium, como el alto grado de esterificación de los polisacáridos pécticos en la pared celular y la falta de sitios de unión para los inductores de callos secretados por Agrobacterium. Pocos o ausentes o evidentemente; diferente de las plantas dicotiledóneas, lo que no favorece la transformación de Agrobacterium. Es precisamente debido a estos conocimientos que la gente ha seleccionado cepas de Agrobacterium y vectores de expresión de plantas apropiados, ha aumentado la concentración de Agrobacterium durante la infección y ha ampliado el tiempo de infección, y ha añadido activadores del gen vir (como AS, OH-AS, lesión de plantas dicotiledóneas, etc.) y la selección de genotipos de receptores, explantes y medios de cultivo apropiados, etc., han logrado un gran avance en la transformación del trigo con Agrobacterium y han obtenido con éxito plantas transgénicas.

En quinto lugar, el trigo en sí es un hexaploide alogénico, con un genoma grande y complejo, y el silenciamiento y la modificación de genes extraños introducidos son más graves.

En sexto lugar, la excesiva confianza en la evidencia de biología molecular del trigo genéticamente modificado. En cierto sentido, esto ha restringido la aplicación del extremadamente ventajoso método de paso del tubo polínico en transgénicos de trigo.

6. Perspectivas del trigo transgénico

Con el establecimiento o establecimiento preliminar de múltiples sistemas de transformación genética para el trigo, el progreso de la investigación del trigo transgénico será más rápido en los próximos cinco años. Pero este progreso se basará en el establecimiento y mejora de sistemas de regeneración de plantas más eficientes. La investigación transgénica basada en armas genéticas pasará a la investigación transgénica mediada por Agrobacterium, que optimizará o mejorará el sistema transgénico del trigo mediado por Agrobacterium.

Al mismo tiempo, la transformación biolística del trigo pasará de la etapa de investigación a la etapa de aplicación, por lo que un pequeño número de líneas o variedades de trigo transgénico entrarán en ensayos de campo o se lanzarán como líneas o variedades. El método de paso del tubo polínico, especialmente su combinación con Agrobacterium, será generalmente aceptado y ampliamente utilizado en las prácticas transgénicas de trigo. Madurarán varios métodos auxiliares mediados por Agrobacterium. Los genes de resistencia a los antibióticos como genes selectivos básicamente desaparecerán en la modificación genética del trigo y serán reemplazados por diferentes genes de resistencia a herbicidas, diferentes genes de azúcar y hormonas. Los genes indicadores que son obvios y beneficiosos para el trigo, como los genes de antocianinas, se utilizarán con mayor frecuencia, por lo que la eficiencia de selección de los transformantes mejorará enormemente. Se introducirán y expresarán más genes de excelentes características agrícolas, especialmente genes de calidad que mejoran el valor nutricional de la harina, mejoran las características de procesamiento de la harina, genes que mejoran la resistencia a las enfermedades de las plantas, genes que mejoran la resistencia a la sequía de las plantas y promueven el uso eficaz del nitrógeno en las plantas. Gen. Se utilizarán ampliamente promotores de mayor potencia y promotores específicos de tejidos y órganos. En algunos laboratorios avanzados también se utilizarán promotores químicamente controlables. Las tecnologías de inserción de copia única, como la "recombinación de sitio específico", serán más completas y aplicadas. El sistema de esterilidad masculina genéticamente modificado se mejorará y se utilizará inicialmente en la producción de semillas híbridas. También se utilizarán genes de resistencia a herbicidas para controlar la pureza de los híbridos. Además, tendremos una comprensión más clara del sitio de inserción y el método de inserción de genes extraños y, por lo tanto, tendremos una comprensión más clara de la expresión y el silenciamiento de genes extraños. Al mismo tiempo, la tecnología de genes antisentido se utilizará inicialmente en el estudio de genes funcionales del trigo.

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1. Transformación genética de plantas

A finales de los años 1970 y principios de los años 1980, se utilizaron plásmidos Ri y Ti de tipo salvaje para transformar el tabaco y la patata. Una vez obtenidas las plantas regeneradas, se estableció la tecnología de transformación genética de plantas utilizando el plásmido Ti como vector. En los últimos años, la tecnología de transformación genética de plantas se ha desarrollado rápidamente y se han establecido una variedad de sistemas de transformación. Según el método de introducción de genes en células vegetales receptoras, la tecnología de transformación genética vegetal se puede dividir aproximadamente en dos categorías: transferencia de genes mediada por vectores y transferencia directa de genes o ADN. La llamada transferencia de genes mediada por vectores es una tecnología que conecta el gen objetivo con un determinado ADN vectorial y luego transfiere el gen extraño a las células vegetales mediante la infección del huésped de la planta receptora, etc. La transferencia directa de ADN se refiere a una tecnología que utiliza las características biológicas de las células vegetales para transferir genes extraños a las células vegetales mediante métodos físicos, químicos y biológicos.

(1) Transformación de vectores La transformación mediada por Agrobacterium es el método de transformación de vectores más importante. Los genes extraños se pueden transferir eficazmente utilizando el plásmido Agrobacterium Ti modificado como vector. Existen dos métodos básicos para la obtención de plantas transformadas: uno es el método de ocultivo utilizando protoplasma vegetal como receptor por Marton et al en 1979; el otro es el método de disco foliar establecido por Horsch et al.

El método de cultivo bacteriano es un método de cocultivo de Agrobacterium y protoplastos de plantas para conseguir su transformación. Los procedimientos incluyen la transformación de protoplastos de la pared celular primaria con Agrobacterium, la selección de células transformadas, la inducción de células transformadas para diferenciar y regenerar plantas.

El método del disco foliar es en realidad un método de transformación creado tras mejorar el método de cultivo bacteriano. Los explantes de hojas se infectaron con Agrobacterium y se cultivaron durante un corto período de tiempo. Durante el proceso de cultivo, se induce el gen vir de Agrobacterium y su activación puede iniciar la transferencia de ADN-T a las células vegetales. Después del cultivo, también se deben llevar a cabo pasos como el cribado de explantes transformados, el cultivo de callos y la inducción de la diferenciación para obtener plantas regeneradas. Dado que el método del disco de hoja no requiere manipulación de protoplastos, el método es simple y más rápido para obtener plantas transformadas. Es una buena manera de utilizar explantes de plantas como materiales para transgénicos.

La transformación genética mediada por Agrobacterium es un método comúnmente utilizado para la transformación de la mayoría de las dicotiledóneas. Sin embargo, debido a las limitaciones del huésped de Agrobacterium, rara vez es capaz de infectar monocotiledóneas, especialmente algunos cultivos importantes como el arroz y el trigo. , maíz, etc. no son sensibles a Agrobacterium y son difíciles de utilizar para la transformación genética mediante este método.

Además de la transformación genética mencionada anteriormente utilizando el plásmido Ti como vector, también se pueden utilizar liposomas como vector para la transformación genética. Los liposomas son estructuras similares a membranas compuestas de fosfolípidos. Por lo tanto, las moléculas de ADN se pueden empaquetar en liposomas para evitar la degradación por la ADNasa en las células receptoras, y las moléculas de ADN se pueden introducir en los protoplastos de las plantas.

(2) Métodos de transferencia directa de genes Esto se refiere a algunos métodos de transferencia de genes que no dependen de Agrobacterium ni de otros vectores o medios.

1. Métodos de estimulación eléctrica y electroinyección. Los pulsos eléctricos pueden cambiar la permeabilidad de las membranas celulares. El método de introducir ADN exógeno en los protoplastos de las plantas mediante electroporación de pulsos eléctricos de alto voltaje se llama electroporación. Este método se ha utilizado ampliamente en la transferencia de genes en plantas y animales monocotiledóneos y dicotiledóneos. Por ejemplo, a finales de la década de 1980, este método se utilizó para transferir el gen de la neomicina fosfotransferasa (NPT II) a líneas endogámicas de maíz, que se ha regenerado. en una planta.

El método de introducir genes directamente en células o tejidos vegetales intactos mediante tecnología de estimulación eléctrica se llama electroinyección. Este método puede evitar las complicadas operaciones y dificultades del cultivo de protoplastos y su regeneración en plantas, por lo que tiene un enorme potencial de aplicación.

2． Método de pistola genética El método de pistola genética también se denomina tecnología de bombardeo de partículas (bombardeo de partículas). Este método utiliza una pistola de partículas para inyectar partículas metálicas con ADN exógeno adsorbido en la superficie en células o tejidos vegetales a alta velocidad. Debido a que este método es rápido y simple, no está limitado por el rango de huéspedes y las células de la planta receptora no necesitan eliminar la pared celular, la tasa de transformación es alta y las células o tejidos transformados pueden regenerarse fácilmente en plantas, por lo que tiene llamó mucho la atención.

3. Microinyección La microinyección es el uso de un microinyector para inyectar directamente genes extraños o ADN en el núcleo o citoplasma de la célula mediante métodos mecánicos. En comparación con otros métodos, este método es más directo y eficaz para la introducción de material genético extraño.

Además de utilizarse en células vegetales, en los últimos años también se ha desarrollado la microinyección para inyectar directamente ovarios vegetales, lo que favorece más la transformación de embriones inmaduros con material genético exógeno. Nuestro país ya realizó exploraciones teóricas y prácticas en esta área en la década de 1970, y obtuvo plantas de algodón transformadas que son resistentes al marchitamiento por fusarium y algodón resistente a los insectos.

2. La tecnología de los animales transgénicos y su aplicación

(1) El concepto de animales transgénicos utiliza tecnología de ingeniería genética para introducir genes extraños de interés en células germinales, células madre embrionarias y embriones tempranos. , y la integración estable en el cromosoma receptor permite al individuo transmitir el gen objetivo extraño a su descendencia a través de diversas vías de desarrollo, es decir, un animal transgénico. El gen diana transferido se llama transgén y el proceso de transferencia del gen diana se llama transgénesis. El concepto de "transgénico" suele limitarse a la transferencia de genes en animales y plantas mediante tecnología de ingeniería genética, por lo que no importa cómo la hibridación sexual o asexual entre variedades obtenga nuevos genes, no entra en esta categoría.

(2) Tecnología animal transgénica La tecnología animal transgénica es una biotecnología desarrollada a principios de la década de 1980 que supera el aislamiento reproductivo entre especies y realiza el intercambio de material genético entre especies animales. Dependiendo de los métodos y objetos utilizados para introducir genes extraños, actualmente existen tres formas principales de producir animales transgénicos: microinyección, retrovirus y métodos de células madre embrionarias. Los métodos básicos de transferencia de genes retrovirales se han introducido anteriormente. Aquí solo presentamos el método de microinyección y el método de células madre embrionarias.

1. Método de microinyección del pronúcleo de óvulos fertilizados La tecnología de microinyección se desarrolló sobre la base de experimentos de transferencia nuclear en la investigación de embriología animal. A principios de la década de 1980, la gente utilizó este método para transferir genes extraños a células germinales animales y estableció con éxito ratones transgénicos.

En 1985, aparecieron ovejas y cerdos transgénicos. Desde entonces, ratas, conejos, pollos, ganado vacuno, peces, etc. transgénicos han logrado sucesivamente el éxito. Se puede observar que la microinyección es la forma más utilizada y eficaz de obtener transgénicos. animales.

Este método utiliza un tubo de vidrio con un diámetro de aproximadamente 1 μm para insertarlo directamente en el pronúcleo masculino del óvulo fertilizado bajo un microscopio, inyectar el ADN del gen extraño contenido en el tubo capilar en el pronúcleo. y luego trasplantarlo a la trompa de Falopio o al útero de la madre pseudoembarazada y convertirse en descendientes. Para comprender la integración de transgenes, se pueden utilizar hibridación por transferencia puntual, reacción en cadena de la polimerasa o hibridación por transferencia Southern para detectar ADN individual de la descendencia, según corresponda.

La ventaja del método de microinyección es que el fragmento del gen exógeno introducido puede tener hasta 50 kb sin necesidad de un vector, y la tasa de integración del gen exógeno en el cromosoma del huésped es relativamente alta. La desventaja es que la integración de genes extraños es aleatoria, por lo que es difícil controlar la tasa de integración; además, la detección de si los genes extraños pueden integrarse de manera estable en el genoma receptor no se puede determinar hasta que nazca y se seleccione la descendencia. No es propicio para su aplicación en ganado grande con períodos de crecimiento prolongados y pocas camadas.

2． Método mediado por células madre embrionarias Las células madre embrionarias (ES) se refieren a células embrionarias indiferenciadas aisladas de la masa celular en la etapa de blastocisto de embriones de mamíferos. Estas células tienen pluripotencia de desarrollo y pueden diferenciarse en varias organizaciones. A mediados de la década de 1980, se empezaron a estudiar métodos para utilizar células ES para obtener animales transgénicos. Este enfoque consiste en introducir directamente genes extraños en las células madre embrionarias, cultivarlas y examinarlas in vitro y luego inyectarlas en la cavidad del blastocisto del receptor, donde se reunirán con las células del blastocisto para formar parte del embrión receptor y participar en su diferenciación. Los animales transgénicos quimera se desarrollan a partir de este embrión, es decir, parte del tejido se deriva de células ES de donantes integradas con genes extraños. Durante el proceso de quimerismo, las células germinales diferenciadas de las células ES transformadas pueden transmitir los genes extraños introducidos mediante hibridación.

En la tecnología del uso de células madre embrionarias como medio para obtener animales transgénicos, se pueden usar varios métodos para introducir genes extraños en las células ES, y la identificación y detección de células son más convenientes y las células se puede identificar previamente a nivel celular, se determina el número de copias, la localización y el nivel de expresión del gen extraño, así como la estabilidad de la inserción, etc. Además, es más fácil inyectar células ES en blastocistos y. la tasa de integración es relativamente alta. Simplemente establecer una línea de células ES en sí es una tarea extremadamente difícil. Aunque se han establecido líneas de células ES de ratón, aún no se han obtenido líneas de células ES verdaderamente estables en cerdos y ovejas.

(3) Aplicación de animales transgénicos El contenido de la investigación sobre animales transgénicos es muy extenso. Desde las décadas de 1980 y 1990, se ha desarrollado con gran profundidad y amplitud desde la teoría básica hasta la tecnología aplicada, y se ha vuelto cada vez más popular. Del laboratorio a la práctica de producción.

1. Aplicación en la investigación de la regulación de la expresión génica El uso de animales transgénicos se puede utilizar como "reactor" para estudiar la regulación de la expresión de genes exógenos in vivo. Lo siguiente sólo presenta como ejemplo la regulación espaciotemporal de los elementos reguladores cis del ADN y los genes en desarrollo. .

(1) Investigación sobre elementos reguladores cis Los niveles anormales de lipoproteínas están relacionados con enfermedades como la aterosclerosis. Los humanos tenemos 5 tipos de lipoproteínas, cada una de las cuales contiene diferentes apolipoproteínas. Se han descubierto unas 17 apolipoproteínas y se han secuenciado sus genes codificantes. Son genes candidatos para el estudio de enfermedades cardiovasculares. La transferencia de genes de apolipoproteína a ratones se puede utilizar para estudiar el metabolismo, la regulación y la aterosclerosis de las lipoproteínas humanas. Al estudiar los elementos reguladores en cis de la expresión específica de tejido del gen de la apolipoproteína, se encontró que hay dos grupos de expresión específica de tejido del gen de la apolipoproteína (Figura 19-15). Un grupo incluye los genes A-Ⅰ, C-Ⅲ y A-Ⅳ, ubicados en las regiones 2 y 3 del brazo largo del cromosoma humano 11 (11q23), y está compuesto en el orden de A-Ⅰ, C-Ⅲ y A. -Ⅳ. La dirección de transcripción de C-III es opuesta a la de los otros dos genes. A-Ⅰ y C-Ⅲ se expresan principalmente en el hígado y el intestino delgado, y A-Ⅳ se expresa principalmente en el intestino delgado. Entre -0,2 y -1,4 pb del gen C-Ⅲ se encuentra la región que regula la expresión del gen A-Ⅰ en el intestino delgado.

Esta región también es un elemento de control para la expresión de los genes C-III y A-IV en el intestino delgado, lo que indica que este elemento puede regular la expresión de todo el grupo de genes de apolipoproteínas en el intestino delgado. Otro grupo de genes se encuentra en las regiones 1 y 3 del brazo largo del cromosoma 19 (19q13), incluidos los genes E, C-I y C-II, que están dispuestos en el orden E, C-I y C-II. El gen E se expresa principalmente en el hígado y en la mayoría de los tejidos del cuerpo, pero en niveles bajos. Posteriormente, se descubrió que existe una brecha entre el gen C-Ⅰ y el gen C-Ⅱ