¡Preguntas sobre experimentos de biología celular! ! ! !
En la vida real
1. A través de la separación de cloroplastos en células vegetales, comprender los principios generales y métodos de separación de orgánulos.
2. Observar la autofluorescencia y fluorescencia secundaria de los cloroplastos y familiarizarse con el uso de microscopios de fluorescencia.
Principios empíricos
El método común para aislar orgánulos es homogeneizar el tejido, suspenderlo en medio isotónico y realizar una centrifugación diferencial. El aislamiento de los cloroplastos debe realizarse en una solución isotónica (0,35 mol/l de cloruro de sodio o 0,4 mol/l de solución de sacarosa) para evitar daños a los cloroplastos causados por cambios en la presión osmótica. Centrifugar el homogeneizado a 1000 rpm durante 2 minutos para eliminar los residuos de tejido y las células intactas. Luego centrifugar a 3000r/5min durante 5 minutos para obtener cloroplastos precipitados (mezclados con algunos núcleos). El proceso de separación se lleva a cabo preferiblemente a 0 ~ 5 °C; si está a temperatura ambiente, se debe separar y observar rápidamente.
Cuando se utiliza un microscopio de fluorescencia para detectar sustancias fluorescentes, se verá afectado por muchos factores como la temperatura, la luz, el extintor, etc. Por lo tanto, debe aprovechar el tiempo durante la observación de la fluorescencia y tomar fotografías inmediatamente cuando sea necesario. Además, al preparar muestras de microscopía de fluorescencia, es mejor utilizar portaobjetos, cubreobjetos y aceite no fluorescentes.
Productos de prueba prácticos
1. Equipo
1. Equipo principal: centrífuga general, triturador de tejidos, balanza gruesa, microscopio de fluorescencia.
2. Equipo pequeño: 2 vasos de precipitados de 500 ml, 1 probeta medidora de 250 ml, 20 goteros, 20 tubos de centrífuga con graduaciones de 10 ml, 5 gradillas de prueba, algo de gasa, 4 láminas de portaobjetos de vidrio no fluorescente y 4 tapas.
En segundo lugar, el material son espinacas frescas.
3. Reactivos: Solución de cloruro sódico 0,35mol/L, naranja de acridina 0,01.
Método de tratamiento experiencial
1. Aislamiento y observación de cloroplastos
1. Seleccionar hojas tiernas de espinacas frescas, lavarlas y secarlas, quitarles los tallos y las venas. y Pese 30 g en 150 ml de solución de NaCl y colóquelos en un triturador de tejidos.
2. Utilice un machacador de tejidos para homogeneizar a baja velocidad (5000 rpm) durante 3 a 5 minutos.
3. Filtrar el homogeneizado a través de 6 capas de gasa en un vaso de precipitados de 500 ml.
4. Tomar 4 ml de filtrado y centrifugar a 1000 rpm durante 2 minutos. Deseche el sedimento.
5. Centrifugar el sobrenadante a 3000 rpm durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante y precipitar los cloroplastos (mezclados con algunos núcleos).
6. Suspender el precipitado con una solución de 0,35 mol/ml.
7. Tomar una gota de suspensión de cloroplasto en un portaobjetos de vidrio, añadir un cubreobjetos y utilizarlo bajo un microscopio normal. microscopio óptico y un microscopio de fluorescencia. Observe a continuación.
(1) Observar bajo un microscopio óptico común.
(2) Observar la fluorescencia directa de los cloroplastos bajo un microscopio de fluorescencia.
(3) Observe la fluorescencia indirecta de los cloroplastos bajo un microscopio de fluorescencia: deje caer una gota de suspensión de cloroplasto en un portaobjetos de vidrio no fluorescente, agregue una gota de colorante fluorescente naranja de acridina al 0,01, cubra el portaobjetos de vidrio, y observar bajo el microscopio de fluorescencia Observar a continuación.
2. Observación del corte manual de hojas de espinaca
Utiliza una hoja de afeitar para cortar las hojas frescas de espinaca en biseles, colócalas sobre un portaobjetos de vidrio y añade de 1 a 2 gotas de 0,35. mol/L de solución de NaCl, cubrir las secciones, presionar ligeramente y observar al microscopio.
(1) Observar bajo un microscopio óptico común.
(2) Observar su fluorescencia directa bajo un microscopio de fluorescencia.
(3) Observación de fluorescencia indirecta: Deje caer de 1 a 2 gotas de solución de tinte naranja de acridina 0,05438 0 en la sección de la mano, tiña durante 1 minuto, lave la solución residual, cubra la sección y observe la fluorescencia indirecta. bajo un microscopio de fluorescencia.
Fruta real
1. Aislamiento y observación de cloroplastos
1 Bajo un microscopio óptico común, podemos ver que los cloroplastos tienen forma de oliva. Bajo un microscopio de alta potencia podemos ver que los cloroplastos contienen partículas de color verde oscuro, es decir, partículas basales.
2. Tomando el microscopio de fluorescencia Olympus como ejemplo, bajo las condiciones de uso del filtro de excitación B (azul), el espejo dicroico B y el filtro de ruptura O530 (naranja), los cloroplastos emiten una fluorescencia de color rojo intenso.
3. Después de la tinción con naranja de acridina, los cloroplastos pueden emitir fluorescencia de color rojo anaranjado y algunos de sus núcleos emiten fluorescencia verde.
2. Observación en corte manual de hojas de espinaca
1. Se pueden observar tres tipos de células (1) células epidérmicas bajo un microscopio óptico común: células escamosas con bordes dentados (2; ) Células protectoras: pares de células con forma de riñón que forman estomas (3) Las células del mesófilo son células oblongas dispuestas en forma de cuadrícula; Los cloroplastos tienen forma de oliva verde y la grana verde es visible bajo un microscopio de alta potencia.
2. Bajo un microscopio de fluorescencia, los cloroplastos emiten una fluorescencia de color rojo intenso, pero su intensidad de fluorescencia es más débil que la de los cloroplastos libres. Los estomas emiten una fluorescencia verde y los cloroplastos de color rojo intenso están dispuestos en las dos células protectoras. en un círculo alrededor de los estomas. El número de cloroplastos en las células epidérmicas es menor que el de las células del mesófilo.
3 Después de la tinción con naranja de acridina, los cloroplastos emiten una fluorescencia de color rojo anaranjado, los núcleos celulares emiten una fluorescencia verde y los estomas permanecen verdes.
Zuo Ye
1. Bajo un microscopio óptico común, utilice un micrómetro visual y un micrómetro de mesa para medir el eje largo y el eje corto de los cloroplastos. Mida de 5 a 10 cloroplastos respectivamente. y encuentre el valor promedio.
2. Al observar la autofluorescencia de los cloroplastos bajo un microscopio de fluorescencia, ¿cambiará el color de los cloroplastos si se reemplaza el sistema de filtro?
Experimento 5: Preparación y observación de especímenes de cromosomas vegetales
Objetivo del experimento
Aprender la tecnología de preparación de especímenes de cromosomas vegetales y comprender los principios básicos de Fulgen reacción Conozca sus métodos de operación y métodos de formación de tabletas, y comprenda inicialmente las características principales de cada etapa de la división celular.
El ácido nucleico es el componente más importante de los organismos vivos. Los ácidos nucleicos se pueden dividir en dos categorías, a saber, ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Su distribución y propiedades químicas en las células son diferentes. El ADN se distribuye principalmente en la cromatina o los cromosomas durante la mitosis. El ARN se distribuye en el citoplasma y el nucléolo. Pero también hay una pequeña cantidad de ARN en la cromatina y los cromosomas, y una pequeña cantidad de ADN en el nucléolo. Además del ARN, también existen orgánulos como las mitocondrias y los cloroplastos.
Principio experimental
El principio de la reacción de Fulgen es que después de que el ADN se hidroliza con un ácido débil (1 mol/L), el enlace entre la purina y la desoxirribosa se abre y en un extremo de la desoxirribosa Formación de grupos aldehídos libres. Estos grupos aldehído se combinan con el reactivo de Schiff in situ para formar compuestos que contienen grupos quinona (). Los grupos aldehído son cromóforos, por lo que tienen color, por lo que dondequiera que haya ADN, aparecerá de color rojo púrpura.
Materiales experimentales
Semillas de cebada, centeno o trigo
Contenido experimental
Preparación de muestras de cromosomas vegetales y métodos de visualización del ADN—— Fulgen reacción
Método de prensado de placa
Observación de la fase de mitosis celular
Pasos experimentales
(1) Preparación de muestras de cromosomas vegetales
1. Coloque las semillas de la planta en papel de filtro húmedo y germine a 20 °C. Cuando la radícula crezca de 1 a 2 cm, corte la punta de la raíz de 0,5 cm de largo.
2.Pretratamiento: Sumergir las puntas de las raíces cortadas en solución de colchicina 0,1 y tratar a temperatura ambiente durante 3-4 horas.
3. Fijación, hidrólisis y teñido:
Fijador de camuflaje
¿Cuánto tiempo tarda en fijarse entre 10 y 30 minutos? 95 alcohol durante 10 minutos? 70 de alcohol durante 10 minutos? ¿Agua destilada → (control) 5 ácido tricloroacético? 90 grados Celsius durante 15 minutos
¿1mol/L HCl ← agua destilada? ¿1mol/L de HCl? 60ºC 8 minutos? ¿Reactivo de Schiff 40 -60 minutos? ¿Sulfito (1, 2, 3)? ¿Cambiar el agua del grifo tres veces durante 5 minutos? ¿Enjuagar la punta de la raíz teñida y colgar el material con buen efecto de teñido? ¿Agua destilada? ¿departamento? Observación microscópica
(2) Método de prensado
Los pasos para prensar son los siguientes: Coloque la punta de la raíz en un portaobjetos de vidrio, corte la punta de la raíz (0,3 cm) con una cuchilla , y corte Corte la punta de la raíz longitudinalmente, agregue una gota de agua, use una aguja de disección para dividir la punta de la raíz en varias tiras longitudinalmente, conserve 1-2 tiras, agregue un cubreobjetos y golpee suavemente el cubreobjetos con la punta de un lápiz para separar las células y aplanarlas en forma de nubes.
(3) Observación de rodajas de punta de raíz de haba (o cebolla).
En primer lugar, bajo un microscopio de baja potencia, se distinguen las células de la zona del meristemo apical de la raíz y de la zona del tejido de elongación. Luego observe la morfología del núcleo celular bajo un microscopio de alta potencia y preste atención a si hay células mitóticas en la película. Si es así, puedes conocer las etapas de la división celular y sus características (ver apéndice)
Varias cuestiones a las que se debe prestar atención al realizar la reacción de Fulgen
Selección del fijador: Habitualmente Se utiliza fijador de Carnoy. Se pueden utilizar otros fijadores, como el fijador de Fleming y el fijador Champy, pero no se puede utilizar el fijador de Bouin.
Tiempo de hidrólisis: El tiempo de hidrólisis debe ser el adecuado y no puede ser demasiado largo ni insuficiente, de lo contrario afectará a los resultados experimentales. Para materiales fijados con fijador de Carnoy, el tiempo de hidrólisis generalmente está entre 8-65438±05 minutos. La duración del tiempo de hidrólisis depende de diferentes materiales y diferentes fijadores.
Calidad del reactivo de Schiff: A la hora de realizar la reacción de Fulgen, un factor importante es la calidad del reactivo de Schiff. Durante el experimento, preste atención a si el color del reactivo es normal y si hay olor a SO2.
La importancia del detergente: Al enjuagar, lo mejor es preparar temporalmente agua con ácido sulfuroso antes de cada experimento para mantener la concentración de SO2.
Grupo de control experimental: asegúrese de hacer fotografías correctas para ilustrar la autenticidad de los resultados experimentales.
Utilice pinzas para eliminar la zona de crecimiento de la punta de la raíz durante la operación y no sujete la corona de la raíz.
Durante el opio, las células del meristemo de la raíz deben mantener su distribución original.
Aplicación
Describe brevemente el principio de la reacción de Fulgen.
¿A qué debemos prestar atención a la hora de realizar una buena membrana de reacción de Fulgen?
Dibuja un diagrama de división celular.
Experimento 6 Preparación de protoplastos vegetales
Propósito experimental
1. Conocer la tecnología de aislamiento y preparación de protoplastos vegetales y observar la morfología de los protoplastos.
2.Aprende la tecnología de fusión de protoplastos vegetales y observa la morfología y los cambios de las células fusionadas utilizando diferentes métodos.
Material experimental
Microscopio, papel limpiador de espejos, tijeras, pinzas, plato pequeño, cuatro pipetas, embudo recto, malla de nailon de malla 300, tubo de centrífuga de 10 ml, portaobjetos y tapa.
Principio experimental
El término protoplasto fue propuesto por primera vez por Hanstein en 1880. En concreto, el protoplasto de los hongos comestibles se refiere a la estructura celular expuesta que queda después de que se elimina por completo la pared celular.
Después de tratar las células de los pétalos de la planta con celulasa y enzimas ionolíticas, los componentes de celulosa y pectina se destruyen, permitiendo que los protoplastos abandonen la pared celular y entren en el medio de cultivo.
Existe una gran cantidad de pigmentos en las vacuolas de las células de los pétalos de las plantas. Los diferentes citocromos son diferentes, por lo que podemos identificar los protoplastos de diferentes células a través de la gama de colores, así como las diferencias entre células homólogas y. fusión de células heterogéneas sin teñir las células.
El PEG es un compuesto polimérico que tiene polaridad negativa debido a sus enlaces éter y forma enlaces de hidrógeno con algunos grupos polares positivos como el agua, las proteínas y los carbohidratos.
Cuando la molécula de PEG es lo suficientemente larga, puede actuar como un puente molecular entre las superficies de los protoplastos adyacentes, permitiéndoles adherirse. PEG también puede conectar Ca2 y otros cationes. Ca2 puede formar un puente entre algunos grupos polares negativos y PEG, promoviendo así la adhesión. Durante el proceso de lavado, las moléculas de PEG adheridas a la membrana del protoplasto serán eluidas, lo que provocará desorden y redistribución de cargas, provocando así la fusión del protoplasto. Los lavados con niveles altos de Ca2 y pH aumentan la fluidez de la membrana plasmática, aumentando así en gran medida la frecuencia de fusión. El shock osmótico durante el lavado también puede influir en la fusión.
Reactivos experimentales
1. Solución de lavado:
Manitol 0,6 M
CaCl2?2H2O 8 mm
¿NaH2PO4? H2O 2 mm
Ph 5,6
Pasos experimentales
1. Preparación de la solución enzimática Disolver celulasa (EAS-867) en 0,5 ~ 0,7 mol/to L de manitol. , agregue una solución de cloruro de calcio de 10 mmol/L como estabilizador. Después de disolver la enzima, los protoplastos se precipitan mediante centrífuga a 4.000 rpm. Después de 20 minutos, se recoge el sobrenadante. Después de filtrar la solución enzimática a través de un filtro de jeringa, se filtra a través de una membrana de filtro microporosa de 0,45 micrones y luego se envasa en matraces Erlenmeyer en una caja estéril y se almacena en el refrigerador para su uso posterior.
2. Materiales: Tomar plantas de tabaco que tengan más de 60 días y que crezcan en el invernadero desde el medio e irradiarlas al sol durante 2 horas para que se marchiten. También se pueden utilizar hojas de frijol cultivadas en invernaderos para el mismo tratamiento, o utilizar zanahorias cosechadas en el campo y almacenarlas a baja temperatura por encima de 0°C para su uso posterior. Remoje las hojas marchitas en concentrado de lejía 3 durante 15 a 20 minutos, luego enjuague con agua esterilizada y use papel absorbente esterilizado para absorber la humedad de la superficie.
3. Hidrólisis enzimática Utilice unas pinzas puntiagudas para arrancar la epidermis inferior de las hojas y cortarlas en trozos pequeños. Corta la piel y la columna central de las zanahorias con una cuchilla de afeitar y corta la piel en trozos pequeños. Coloque 65438 ± 0 g de los materiales anteriores en una placa de Petri que contenga 65438 ± 00 ml de solución enzimática y cúbrala con la tapa. Mantenga la temperatura entre 28 y 30 ℃ durante 1,5 a 3 horas.
4. Después del lavado de hojas u otros tejidos, aparecerán protoplastos redondos libres. Hay tejidos no digeridos, fragmentos, células y protoplastos rotos en la suspensión de protoplastos. Filtrar las impurezas gruesas con papel de filtro o tela de nailon, luego transferir la suspensión de protoplastos a un tubo de centrífuga, centrifugarla en una centrífuga manual durante 2 minutos, aspirar el sobrenadante (ver imagen), luego agregar 0,5 ml de manitol y lavar durante 2 a 3 segundos veces y finalmente obtener protoplastos relativamente puros, que pueden usarse para cultivos posteriores u otros experimentos.
Experimento 7 Método de Fusión Celular
Propósito Experimental
1. Dominar preliminarmente el método de fusión con PEG de células animales.
2.Comprender la fusión celular y sus aplicaciones.
Principio experimental
El fenómeno de fusión de dos o más células en 1 célula se llama fusión celular. Los principales métodos de fusión celular incluyen el método viral, el método de polietilenglicol (PEG) y el método de electrofusión.
El tratamiento de células con PEG puede cambiar las propiedades de la membrana plasmática, lo que lleva a la fusión de la membrana celular, al reciclaje citoplasmático y, en última instancia, a la fusión celular.
Equipo experimental, materiales y reactivos
1. Instrumentos:
Microscopio óptico, centrífuga, baño María a temperatura constante, incubadora de CO2, mesa ultralimpia, inversión. Microscopio etc
2. Materiales
Glóbulos rojos de pollo frescos, jeringa estéril, aguja nº 6, tubos de centrífuga graduados, tubos de ensayo, portaobjetos de vidrio y cubreobjetos.
3. Reactivos
50 polietilenglicol, solución de Hanks, metanol, solución de colorante Giemsa, yodo, 75 etanol.
Método experimental
(1) Hacer una suspensión al 10% de sangre fresca de pollo con 0,85% de solución salina normal.
(2) Pese 0,5 g de PEG (MW = 4000), colóquelo en un tubo de ensayo, derrítalo en una lámpara de alcohol y agregue rápidamente 0,5 ml de solución de Hanks precalentada para obtener una solución de 50 PEG. Colocar en un baño de agua a 37°C para su uso posterior.
(3) Coloque 1 ml de la suspensión de 10 glóbulos rojos de pollo anterior en un tubo de centrífuga, agregue 5 ml de solución de Hanks y mezcle bien, luego centrifugue a 1000 rpm durante 5 minutos y deseche con cuidado el sobrenadante. . solución y use movimientos con los dedos para romper los grupos de células.
(4) Tome 0,5 ml de la solución de 50 PEG anterior y colóquelos en la suspensión de glóbulos rojos de pollo dentro de 65438 ± 0 minutos, agitando suavemente mientras agrega. Luego de agregar todo el PEG, dejar reposar por aproximadamente 65.438 ± 0 minutos. Todo este proceso requiere un baño de agua a 37°C.
(5) Agregue lentamente 9 ml de solución de Hanks gota a gota para terminar el efecto del PEG y déjelo reposar en un baño de agua a 37 °C durante 5 minutos.
(6) Después de centrifugar y desechar el sobrenadante, tomar una gota de la suspensión de células fusionadas y cubrirla para su examen microscópico.