¿Qué es cdna?
cdna se refiere al ADN complementario.
Introducción a cdna:
Es la abreviatura de ADN complementario, un ADN monocatenario con una secuencia de bases que es complementaria a una determinada cadena de ARNm (ARN mensajero), o esta La cadena de ADN tiene la misma secuencia de bases que las dobles cadenas de ADN formadas por cadenas de ADN con secuencias de bases complementarias. El ADN monocatenario complementario a la cadena de ARN se sintetiza utilizando ARN como plantilla y en presencia de cebadores apropiados mediante la acción de la ADN polimerasa dependiente de ARN (transcriptasa inversa).
Y después de sintetizar el ADNc monocatenario y eliminar el ARN correspondiente mediante tratamiento alcalino, el ADNc monocatenario se utiliza como plantilla y se sintetiza mediante la acción de la ADN polimerasa o ARN dependiente de ADN. ADN polimerasa dependiente.
Recombinación del ADNc:
① Con la ayuda de la capacidad del extremo 3'-OH de la transferasa terminal para sintetizar homopolímeros, el extremo 3'-OH del ADNc bicatenario y Las cadenas de nucleótidos del homopolímero de ADN del vector linealizado se añadieron por separado.
② El ADNc de doble cadena y el ADN del vector linealizado se rellenaron en los extremos usando fragmentos de Klenow y luego se ligaron homogéneamente usando ADN ligasa T4 para formar el recombinante.
③Conectar a través de extremos adhesivos.
Transformación:
Las moléculas de ADN del vector recombinante se transforman en E. coli bajo ciertas condiciones para formar una cepa portadora del plásmido. Cuando diferentes ADN recombinantes contienen diferentes genes de ADNc, el transformante completo contiene varios genes de ADNc de la población de ARNm, y dicha población transformante constituye una biblioteca de genes de ADNc de toda la información genética del ARNm.
Síntesis de CDNA bicatenario:
Síntesis de CDNA de primera cadena:
Previa obtención del ARNm mediante cromatografía de afinidad, según el extremo 3' de la molécula de ARNm Basado en el principio de la estructura de la cola de poli(A), se mezcla oligo(dT) de 12 a 20 nucleótidos de longitud con ARNm purificado que se combinará con poli(A) como cebador para la transcriptasa inversa. La reacción es una cadena híbrida de ARN-ADN.
El oligo (dT) se une al extremo 3' del ARNm, por lo que sintetizar el ADNc de longitud completa requiere la transcriptasa inversa para moverse de un extremo de la molécula de ARNm al otro. En ocasiones, esta síntesis total es difícil de lograr. , especialmente cuando la cadena de ARNm es muy larga, se establece un método de cebador aleatorio para sintetizar el ADNc.
Síntesis de la segunda hebra de ADNc:
Utilizando las características de un bucle en horquilla que suele aparecer en el extremo 3' de la primera hebra de ADNc. Esta estructura en horquilla es al revés. transcriptasa en la primera cadena. El extremo de una cadena se "pliega" y replica la primera cadena, lo que proporciona cebadores útiles para la síntesis de la segunda cadena de ADNc. El ADNc bicatenario sintetizado mediante este método tiene en un extremo un bucle en forma de horquilla que se puede cortar con una nucleasa S1 específica monocatenaria.
Sin embargo, el tratamiento con la nucleasa S1 a menudo "recorta" demasiada secuencia de ADNc, lo que hace que el ADNc pierda parte de la secuencia en el extremo 5' del ARNm.