Documento sobre la vacuna contra la hepatitis B
Capítulo 2 Productos farmacéuticos modificados genéticamente
Sección 1 Descripción general
Sección 2 Proceso de producción de medicamentos modificados genéticamente
Sección 3 Adquisición de genes diana
Sección 4: Expresión genética
Sección 5: Crecimiento y características metabólicas de bacterias genéticamente modificadas
Sección 6: Estabilidad de bacterias genéticamente modificadas
Sección 7: Prueba piloto de bacterias genéticamente modificadas
Sección 8: Cultivo de bacterias genéticamente modificadas
Sección 9: Fermentación de alta densidad
Sección 10: Separación y purificación de medicamentos genéticamente modificados
Sección 11: Renaturalización de proteínas desnaturalizadas
Sección 12: Control de calidad de medicamentos genéticamente modificados
Sección 13 Ejemplos de fabricación genéticamente Medicamentos bacterianos modificados
Descripción general de la sección 1
El papel de la ingeniería genética en la farmacia
Principales categorías de medicamentos modificados genéticamente
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Ventajas de los medicamentos de ingeniería genética
Introducción al desarrollo de medicamentos de ingeniería genética en el país y en el extranjero
La brecha con los niveles avanzados extranjeros
Las principales ventajas de Medicamentos de ingeniería genética Categoría
1. Hormonas: insulina, hormona del crecimiento
2. Proteínas inmunes: anticuerpos monoclonales, vacunas
3. /p>
4. Enzimas: uroquinasa, superóxido dismutasa
Ventajas de la ingeniería genética para producir fármacos
1. Grandes beneficios y servicio más eficaz a la sociedad.
2. Mayor eficiencia de producción
3. Mejorar aún más la actividad farmacológica, como la ingeniería de proteínas.
4. Promover la adquisición de nuevos fármacos: cribar nuevos compuestos
5..?
Ingeniería genética (ingeniería genética):
Transferir conscientemente genes útiles de interés de un organismo a otro, para que este último pueda obtener nuevos rasgos genéticos o requisitos de expresión del producto.
Medicamentos proteicos raros y valiosos
En 1982, la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. aprobó el primer producto genéticamente modificado: la insulina humana, lo que marcó el lanzamiento oficial de la comercialización de productos genéticamente modificados.
Hormona de crecimiento humano, factor de crecimiento epidérmico, factor de necrosis tumoral, interferón-A, celulasa, factor antihemofílico, eritropoyetina, prouroquinasa, interleucina-2, factores estimulantes de colonias, vacuna contra la hepatitis B, etc.
Aplicaciones en ganadería
Vacunas para animales, hormonas de crecimiento, etc.
Ejemplo: el tPA, un fármaco para tratar enfermedades cardíacas, se extrae de la leche de ovejas genéticamente modificadas.
Aplicación en la industria de la plantación
Utilice el plásmido Agrobacterium Ti que porta genes exógenos para transformar los protoplastos de las plantas, de modo que el ADN exógeno pueda integrarse con el ADN cromosómico de la planta y diferenciarse mediante el cultivo de protoplastos como callo, eventualmente se convierte en una planta completa con nuevas características: una planta transgénica.
Aplicación en la industria vegetal
Gen de resistencia a herbicidas químicos
Tomate transgénico
Gen de la nitrógenoasa
ADN humano
……
Protección del medio ambiente, etc.
Sección 2+3
Tecnología del ADN recombinante
1 La tecnología del ADN recombinante es la tecnología central de la ingeniería genética.
2. Obtener los genes diana necesarios (genes extraños)
3. Construcción de plásmidos recombinantes y clonación de genes
Transformación de células receptoras y cribado de transformantes
Análisis de 5 transformantes: hibridación del Sur
El avance de la tecnología del ADN recombinante condujo al surgimiento de la biotecnología moderna y pronto dio origen a muchas industrias de alta tecnología en las ciencias de la vida.
La tecnología del ADN recombinante, también conocida como tecnología de clonación genética o molecular, es la tecnología central de la ingeniería genética. Esta tecnología implica una serie de procedimientos de biología molecular.
1 La tecnología del ADN recombinante es la tecnología central de la ingeniería genética.
Pasos generales para las operaciones de ADN recombinante:
(1) Obtener el gen objetivo
(2) Conectarlo al vector de clonación para formar un nuevo recombinante; Molécula de ADN;
(3) Utilizar moléculas de ADN recombinante para transformar las células receptoras y replicarlas y heredarlas en las células receptoras.
(4) Examinar e identificar transformantes; >
(5) Cultivar células u organismos con genes exógenos para obtener los rasgos genéticos deseados o expresar los productos deseados.
(1) Construir una biblioteca de genes y luego llamar al gen objetivo a partir de ella.
(2) Usar ARNm como plantilla y utilizar transcripción inversa para sintetizar fragmentos de ADN complementarios; p>
(3) Amplificación por PCR del fragmento del gen diana.
(4) Modificación de genes antiguos
(5) Síntesis química de genes (cortos)
2. Métodos básicos para obtener genes diana
Extracción y separación de ADN total en células y construcción de biblioteca genética
Método de extracción y separación de ADN total en células
Construcción de biblioteca genética
El ADN total Los fragmentos del genoma que contienen se clonan en plásmidos o vectores de fagos para formar una biblioteca de genes biológicos.
Sintetizar ADN complementario mediante transcripción inversa
El problema de construir una biblioteca de genes para obtener el gen objetivo:
Requiere tiempo y problemas.
Secuencia de intrones
Ventajas de sintetizar ADN complementario mediante transcripción inversa:
Los fragmentos de ADN obtenidos suelen ser genes diana con funciones específicas.
Reacción en cadena de la polimerasa
La tecnología PCR es una tecnología que amplifica selectivamente (incluido el aislamiento) un gen diana mediante una reacción enzimática in vitro.
Agregue cuatro sustancias:
(1) secuencia de ADN como plantilla
(2) 5' de ambas cadenas del gen diana aislado con cebadores de ADN complementarios; secuencias finales (cadenas simples de ADN cortas de aproximadamente 20 bases);
(3) TaqDNA polimerasa;
(4) dNTP (dATP, dTTP, dGTP y dCTP).
Reacción en cadena de la polimerasa
Trilogía de desnaturalización, hibridación y extensión
Desnaturalización: el ADN bicatenario se funde en ADN monocatenario.
Recocido: Algunos cebadores se emparejan con porciones complementarias específicas del ADN monocatenario molde.
Extensión: Síntesis de nuevas cadenas de ADN complementarias utilizando el gen diana como plantilla.
Reacción en cadena de la polimerasa
Cada ronda de reacción en cadena de la polimerasa duplica el fragmento del gen diana.
Después de 30 ciclos se pueden obtener -230 (1,07× 109) fragmentos del gen.
Métodos básicos para la obtención de genes diana (continuación)
4. Transformación de proyectos de genes-proteínas antiguos
5. Síntesis química de genes (cortos)
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Las herramientas más importantes para la recombinación y clonación de genes son las enzimas de restricción, los vectores y las bacterias huésped.
Se debe clonar una pequeña cantidad del gen de interés para obtener un gran número de copias antes de poder lograr una mayor recombinación, transformación y expresión.
3. Construcción de plásmido recombinante y clonación de genes
Endonucleasa de restricción
La endonucleasa de restricción es una endonucleasa aislada y purificada de bacterias Dicer es un bisturí molecular que reconoce. y corta sitios específicos en una secuencia de ácido nucleico.
Arber, Smith y Nathans ganaron el Premio Nobel en 1978 por su trabajo pionero en el descubrimiento de las enzimas de restricción.
Endonucleasas de restricción
Se han descubierto y caracterizado más de 200 especies
EcoRI reconoce específicamente la doble hebra compuesta por GAATTC y su fragmento de bases complementarias.
Final infeliz
Ligasa T4
Vector
Vector es una herramienta para transportar el fragmento del gen objetivo a la célula huésped. Actualmente, los vectores más utilizados incluyen plásmidos bacterianos, fagos L, plásmidos cósmidos, etc.
El plásmido es una molécula de ADN circular que existe naturalmente fuera del cromosoma de las células bacterianas y puede replicarse de forma autónoma. Un plásmido que ingresa a una célula huésped puede aumentar considerablemente su número de copias.
A. Los plásmidos son relativamente pequeños y pueden insertar fragmentos de ADN más largos.
B. Después de ingresar a la célula bacteriana huésped, pUC18 puede replicarse para formar aproximadamente 500 copias en cada célula.
cEn pUC18 hay una secuencia corta diseñada artificialmente con varios sitios de restricción, es decir, un sitio de clonación múltiple.
Plásmido bacteriano pUC18
El sitio de clonación múltiple del plásmido pUC118 se integró en el gen lacZ. Si no se inserta ningún gen diana extraño en este sitio, se puede expresar el gen lacZ. Galactosidasa, si el medio de la placa contiene IPTG y X-gal, ¿qué hará X-gal? La galactosidasa lo hidroliza en azul y E. coli forma colonias azules.
Inserta el gen diana extraño en múltiples sitios de clonación, destruye la estructura del gen lacZ y forma clones blancos en E. coli.
Plásmido recombinante de cribado de inactivación de inserción del gen D.lacZ.
E puc 18 también porta un gen de resistencia a la ampicilina y puede usarse para detectar plásmidos recombinantes.
Lactosa (4-D-glucosa?-galactopiranósido) y alolactosa
Clonación de genes utilizando Escherichia coli como bacteria huésped
El propósito Procedimiento para clonar genes en Células de E. coli:
a. Obtener el gen objetivo y el vector plásmido;
b. Formar un plásmido recombinante;
c. . coli con plásmido recombinante;
d. Cultivar E. coli para formar una gran cantidad de copias del plásmido recombinante y
e. plásmido. Células de E. coli, examen o identificación.
Métodos de detección e identificación de genes clonados comunes
La electroforesis en gel de agarosa separa e identifica fragmentos enzimáticos de diferentes tamaños:
El grupo fosfato está cargado negativamente.
Los fragmentos enzimáticos se mueven hacia el ánodo.
Fuerza impulsora del campo eléctrico y resistencia del gel
-Diferente movilidad
Referencia estándar de peso molecular
Métodos de digestión enzimática y electroforesis
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Sonda molecular de ADN marcada con 32P
Hibridación
Radiografía automática
Identificación directa de la hibridación de ADN
Una vez que se obtiene una gran cantidad de genes diana mediante la clonación de genes, es necesario expresarlos en células huésped adecuadas para producir los productos de expresión génica requeridos o para que los organismos huéspedes tengan las características requeridas. heredado de forma estable en las células huésped. Este proceso es la transformación genética.
Si el gen clonado necesita expresarse y producir una gran cantidad de proteína codificada, se puede cultivar E. coli transformada para expresar y acumular una gran cantidad del gen diana. El producto deseado se puede obtener aislando y purificando el producto de expresión.
Los plásmidos recombinantes construidos mediante tecnología de recombinación de ADN in vitro también se pueden utilizar directamente para transformar procariotas, como cianobacterias u otros protozoos.
Cribado de células receptoras transformadas y transformantes
Métodos comunes de transformación genética
Transformación vectorial - Transformación mediada por Agrobacterium
Transferencia directa de genes
(1) Perforación por estimulación eléctrica por pulso eléctrico de alto voltaje
(2) Método de pistola genética
(3) Método de microinyección
p>En memoria del inventor Edward Southern
(1) Extracto de ADN total
(2) Hidrólisis enzimática
(3) Electroforesis
(4) Transferencia a membrana filtrante
(5) Desnaturalización y fusión
(6) Sonda de ADN e hibridación
(7) Elución
(8) Autorradiografía
(9) Análisis comparativo
Análisis de 5 transformantes - Hibridación Southern
Ejemplos de análisis de hibridación Southern
A. Experimento de recombinación de ADN in vitro
B. Uso de antibióticos para detectar células transformadas
c.
Los resultados de la hibridación de D.southern indican que el gen diana extraño se ha transferido a las células mutantes.
Durante 1973, el equipo de investigación dirigido por el profesor Cohen de la Universidad de Stanford y el profesor Boyer de la Universidad de California completaron la recombinación de ADN in vitro casi simultáneamente, abriendo la puerta a la ingeniería genética.
Sección 4 Expresión génica
Selección de células huésped
Expresión génica en E. coli
Expresión génica en levadura
Expresión genética en células animales
1. Expresión de bacterias huésped
Requisitos previos de la célula huésped: 7 puntos
Expresión genética de bacterias huésped Se puede dividir en dos categorías .
Bacterias huésped comunes
1. Células procariotas: 3 tipos.
2. Hongos: 2 tipos
¿Cuáles son las características de los huéspedes anteriores?
En segundo lugar, expresión de genes extraños en E. coli
1. Seis características básicas de genes eucariotas en vectores de expresión de E. coli
2. -pbv 220 y sistema pET
3. Cinco factores que afectan la expresión de genes diana
4 Tres formas de expresión de genes eucariotas en E. coli
Seis. Características básicas de los vectores de expresión de E. coli
1. Replicón independiente
2. Múltiples sitios de clonación
3. Promotor fuerte. . Terminador fuerte
5. Supresor
6. Secuencia Shine-Delgarno & August
Cinco factores que afectan la expresión de genes diana en E. coli.
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1. Dosificación del gen
2. Eficiencia de expresión
3. Estabilidad de los productos de expresión:
a Intensidad de transcripción, eficiencia de traducción B (ribosoma). unión, secuencia SD, preferencia de codones)
4. Carga metabólica del huésped E. coli
5. Condiciones de cultivo de bacterias de ingeniería
Tres formas de expresión de eucariotas. genes en E. coli
1. Proteína de fusión
2. Expresión secretada
3. Expresión ordinaria
3. genes en Saccharomyces cerevisiae
1 Portador:
Cuatro categorías, YEp, YRp, YCp, YIp.
Vectores de clonación y vectores lanzadera
Vectores de expresión: vectores de expresión ordinarios y vectores de expresión de precisión.
2. Factores que afectan a la expresión de genes diana en levadura
1. Dosificación de genes exógenos
2. >①La fuente del promotor
②La eficacia del terminador
③La eficiencia de la secreción de señales.
3. Glicosilación de proteínas extrañas
4. Influencia de las cepas huésped
Sección 5: Crecimiento y metabolismo de cepas genéticamente modificadas
La relación entre crecimiento celular y energía
Palabras clave: suministro de oxígeno/energía/subproductos/crecimiento celular
La relación entre crecimiento celular y suministro frontal
Palabras clave : Requisitos previos/
Inestabilidad de cepas genéticamente modificadas
Estabilidad de cepas y plásmidos
Seis métodos para mejorar la estabilidad de los plásmidos
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Sección 6: Inestabilidad de cepas genéticamente modificadas
Sección 7: Prueba piloto de cepas genéticamente modificadas
Propósito de la prueba piloto
Proceso piloto
Sección 8 Cultivo de cepas genéticamente modificadas
1. Método de cultivo (fermentación) de cepas genéticamente modificadas
Siete elementos de la tecnología de fermentación bacteriana genéticamente modificada
Equipos de fermentación para cepas genéticamente modificadas
Sección 9 Fermentación de alta densidad
Alta densidad: conceptos y funciones
Influencia de los factores de fermentación de alta densidad
Cómo lograr una fermentación de alta densidad
La necesidad de establecer un proceso de separación y purificación
Pasos básicos de separación y purificación
Separación y purificación Tecnología
1. ¿Cómo elegir el proceso de separación y purificación adecuado?
2. Disrupción celular y separación sólido-líquido
3. Aislamiento y purificación de productos objetivo
Conceptos básicos para la selección de procesos de separación y purificación
1. Según la forma de desempeño del producto.
2. Según la conexión entre las unidades de separación
3. Según los requisitos básicos del proceso de separación y purificación
Sección 10: Separación y Purificación de fármacos genéticamente modificados
Sección 11 Renaturalización de proteínas desnaturalizadas
Cuerpos de inclusión y las razones de su formación
Descomposición y disolución de inclusiones
Cuerpos de inclusión Método de replegamiento
Control de calidad de las materias primas
Control de calidad durante el proceso de cultivo
Control de calidad durante el proceso de depuración
Control de calidad del producto objetivo
1. Identificación del producto
2. Análisis de pureza
3. 4. Estabilidad
p>5. Consistencia del producto
Almacenamiento de los productos
Sección 12 Control de calidad de medicamentos genéticamente modificados
Interferón- Interferón humano Preparación de α2b
Factor estimulante de colonias de granulocitos humanos
Interleucina 2 humana
Sección 13 Ejemplos de fabricación de medicamentos modificados genéticamente