Principios y aplicaciones de la secuenciación de segunda generación
Los principios y aplicaciones de la secuenciación de segunda generación se presentan a continuación:
La secuenciación de segunda generación, también conocida como secuenciación de alto rendimiento, se desarrolla en base a PCR y chips genéticos. Tecnología de secuenciación de ADN.
Acerca de la aplicación clínica de la secuenciación de segunda generación:
Como método de detección, la secuenciación de segunda generación se utiliza principalmente para la variación reproductiva (hereditaria) y la variación somática (adquirida) de genes. detección. Para las enfermedades genéticas, las principales soluciones técnicas son la secuenciación de paneles específicos, la secuenciación del exoma completo (exoma completo), la secuenciación del genoma completo (genoma completo) y la secuenciación del ADN mitocondrial.
Entre ellos, la secuenciación de regiones específicas se dirige principalmente a genes relacionados con enfermedades con fenotipos claros. Los paneles comunes incluyen: panel de inmunodeficiencia, panel de síndrome de insuficiencia de la médula ósea, panel de defectos cegadores o ensordecedores y panel de enfermedad mitocondrial. panel de enfermedades, panel de enfermedades neurológicas, panel de enfermedades del tejido conectivo, panel de miocardiopatía y panel de susceptibilidad a tumores hereditarios, etc.
La característica más importante de las soluciones de secuenciación dirigida es que diferentes laboratorios analizarán diferentes rangos de genes debido a limitaciones de edad en la formulación del protocolo y el diseño del panel. Para la detección de tumores, debido a los diferentes tipos de muestras, el diseño de escenarios de uso es diferente.
La mayoría de ellos se dividen en: 1. Apuntar a la región codificante de cada gen, o agregar UTR o incluso relleno de exón, para descubrir mejor mutaciones de empalme (mutaciones de empalme), 2. Apuntar a puntos de acceso específicos (paneles de puntos críticos) para determinada evidencia clínica o objetivos de fármacos/sitios de resistencia.
Además, la NIPT basada en ADN libre de células fetales es también un ejemplo de aplicación muy clásico de secuenciación de segunda generación en medicina traslacional. A medida que la tecnología madura, la secuenciación de segunda generación también ha comenzado a utilizarse en la detección de ADN libre de células tumorales, tipificación de HLA, detección de patógenos, secuenciación de transcriptomas y secuenciación de metilación.
Sin embargo, todavía existen preocupaciones en la comunidad académica sobre la aplicación de estos campos, especialmente la aplicación de la secuenciación de segunda generación de ctDNA para la detección temprana de tumores. El autor plantea principalmente dos puntos: 1. También se puede encontrar en el ADN libre de personas normales. Detección de mutaciones conductoras falsas positivas. 2. En algunos tumores en etapa temprana, la sensibilidad del ctDNA NGS puede ser insuficiente (30 ~ 60). Estos dos puntos pueden limitar la aplicabilidad del ctDNA para la detección temprana de tumores.
Acerca de la solución técnica de la secuenciación de segunda generación:
La principal solución técnica actual de la secuenciación de segunda generación es la secuenciación de regiones específicas (panel). El análisis principal se distingue por la tecnología. obtenido de la región objetivo es tecnología de captura en fase líquida (usando sonda de ARN o sonda de ADN) y tecnología de captura de región objetivo por PCR. Normalmente, la captura en fase líquida implica primero fragmentar el ADN en longitudes específicas (digestión enzimática o sonicación), agregar adaptadores y luego capturar con sondas. La captura por PCR no requiere fragmentación del ADN. Enriquece directamente la región objetivo mediante PCR y luego agrega adaptadores.
No importa qué tecnología de captura se utilice, la secuenciación de la región objetivo generalmente tiene los siguientes pasos: extracción de ADN, preparación de la biblioteca, enriquecimiento de la región objetivo y secuenciación en máquina.
Extracción de ADN:
La extracción de ADN convencional generalmente puede cumplir con los requisitos de muestra para la secuenciación de segunda generación. Sin embargo, se debe tener especial cuidado al manipular muestras FFPE de tumores, especialmente para muestras antiguas. El daño y la degradación del ADN son muy comunes, y las muestras FFPE generalmente se someten a pasos de microdisección y desparafinado, que también pueden afectar la disminución del rendimiento del ADN. Qubit, un paso de control de calidad muy crítico en la extracción de ADN, generalmente se elige para la cuantificación, porque el valor de medición del Qubit de ADN de baja concentración es relativamente más sensible que NanoDrop.