¿Qué es un microscopio electrónico?
Los microscopios electrónicos más utilizados son el microscopio electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM). En comparación con los microscopios ópticos, los microscopios electrónicos reemplazan la luz visible con haces de electrones, reemplazan las lentes ópticas con lentes electromagnéticas y usan pantallas fluorescentes para obtener imágenes de haces de electrones invisibles a simple vista. En comparación con los microscopios ópticos, los microscopios electrónicos reemplazan la luz visible con haces de electrones, reemplazan las lentes ópticas con lentes electromagnéticas y usan pantallas fluorescentes para obtener imágenes de haces de electrones invisibles a simple vista.
Principio de imagen
1. Tecnología de microscopía electrónica de transmisión Tecnología de microscopía electrónica de transmisión
La microscopía electrónica de transmisión utiliza haces de electrones para atravesar la muestra después de enfocarla y ampliarla para producir una imagen del objeto, que se proyecta en una pantalla fluorescente o película fotográfica para su observación. La microscopía electrónica de transmisión utiliza un haz de electrones para pasar a través de una muestra después de ser enfocada y amplificada para producir una imagen de objeto, que se proyecta en una pantalla fluorescente o película fotográfica para su observación. La resolución de un microscopio electrónico de transmisión es de 0,1 a 0,2 nm y el aumento es de decenas de miles a cientos de miles de veces. La resolución de un microscopio electrónico de transmisión es de 0,1 a 0,2 nm y el aumento es de decenas de miles a cientos de miles de veces. Dado que los objetos dispersan o absorben fácilmente los electrones, el poder de penetración es bajo y se deben preparar secciones ultrafinas más delgadas (generalmente de 50 a 100 nm). Dado que los objetos dispersan o absorben fácilmente los electrones, el poder de penetración es bajo y se deben preparar secciones ultrafinas más delgadas (generalmente de 50 a 100 nm). El proceso de preparación es similar al corte en parafina, pero los requisitos son extremadamente estrictos. El proceso de preparación es similar al corte en parafina, pero los requisitos son extremadamente estrictos. Para recolectar el tejido unos minutos después de la muerte del cuerpo, el bloque de tejido debe ser pequeño (dentro de 1 milímetro cúbico) a menudo se usan glutaraldehído y ácido de inanición para la doble fijación y la incrustación de resina, y luego se corta en piezas ultrafinas. Luego se tiñeron electrónicamente las secciones en un ultramicrótomo especial con acetato de uranilo y citrato de plomo. Para recolectar el tejido unos minutos después de la muerte del cuerpo, el bloque de tejido debe ser pequeño (dentro de 1 milímetro cúbico) a menudo se usan glutaraldehído y ácido de inanición para la doble fijación y la incrustación de resina, y luego se corta en piezas ultrafinas. Luego se tiñeron electrónicamente las secciones en un ultramicrótomo especial con acetato de uranilo y citrato de plomo. Cuando el haz de electrones se proyecta sobre la muestra, puede producirse la correspondiente emisión de electrones dependiendo de la densidad de los componentes del tejido. Por ejemplo, cuando el haz de electrones se proyecta sobre una estructura con una gran masa, los electrones se dispersan más, por lo que los electrones. proyectadas en la pantalla fluorescente son menores y aparecen oscuras, como en las fotografías electrónicas. Cuando el haz de electrones se proyecta sobre la muestra, puede producirse la correspondiente emisión de electrones dependiendo de la densidad de los componentes del tejido. Por ejemplo, cuando el haz de electrones se proyecta sobre una estructura con una gran masa, los electrones se dispersan más, por lo que los electrones. proyectadas en la pantalla fluorescente son menores y aparecen oscuras, como en las fotografías electrónicas. Se llama denso en electrones. Se llama alta densidad electrónica. Por el contrario, se llama transparencia de electrones. Por el contrario, se le llama baja densidad electrónica (electronlúcida).
2． Microscopía electrónica de barrido Microscopía electrónica de barrido
La microscopía electrónica de barrido utiliza un haz de electrones extremadamente fino para escanear la superficie de la muestra. Los electrones secundarios generados se recogen con un detector especial para formar una señal eléctrica y se transportan a la imagen. tubo, que se muestra en la pantalla fluorescente Muestra objetos. El microscopio electrónico de barrido utiliza un haz de electrones extremadamente fino para escanear la superficie de la muestra. Los electrones secundarios generados se recogen con un detector especial para formar una señal eléctrica y se transportan al tubo de imagen para mostrar el objeto en la pantalla fluorescente. Se puede fotografiar la configuración tridimensional de la superficie (células, tejidos). Se puede fotografiar la configuración tridimensional de la superficie (células, tejidos).
La muestra del microscopio electrónico de barrido se fija con glutaraldehído y ácido de inanición. Después de la deshidratación y el secado en el punto crítico, se rocía una fina capa de película de oro sobre la superficie de la muestra para aumentar el número de electrones de segunda onda. . Las muestras de microscopio electrónico de barrido se fijan con glutaraldehído y ácido de inanición y, después de la deshidratación y el secado en el punto crítico, se rocía una fina capa de película de oro sobre la superficie de la muestra para aumentar el número de electrones de segunda onda. El microscopio electrónico de barrido puede observar estructuras de superficie de tejido más grandes. Gracias a su gran profundidad de campo, se pueden visualizar claramente superficies irregulares de aproximadamente 1 mm, por lo que la imagen de la muestra está llena de tridimensionalidad. El microscopio electrónico de barrido puede observar estructuras de superficie de tejido más grandes. Gracias a su gran profundidad de campo, se pueden visualizar claramente superficies irregulares de aproximadamente 1 mm, por lo que la imagen de la muestra está llena de tridimensionalidad.
Conocimientos relacionados
1. Los microscopios ópticos utilizan luz visible como medio y los microscopios electrónicos utilizan haces de electrones como medio, ya que la longitud de onda del haz de electrones es mucho más pequeña que la del haz de electrones. En la luz visible, la resolución del microscopio electrónico es mucho mayor que la del microscopio óptico. Los microscopios ópticos utilizan luz visible como medio y los microscopios electrónicos utilizan haces de electrones como medio. Dado que la longitud de onda del haz de electrones es mucho más pequeña que la de la luz visible, la resolución del microscopio electrónico es mucho mayor que la del microscopio óptico. . Los microscopios ópticos sólo tienen un aumento máximo de aproximadamente 1.500 veces, mientras que los microscopios de barrido pueden aumentar hasta más de 10.000 veces. Los microscopios ópticos sólo tienen un aumento máximo de aproximadamente 1.500 veces, mientras que los microscopios de barrido pueden aumentar hasta más de 10.000 veces.
2. Según la teoría de ondas de de Broglie, la longitud de onda del electrón sólo está relacionada con el voltaje de aceleración: Según la teoría de ondas de de Broglie, la longitud de onda del electrón sólo está relacionada con el voltaje de aceleración :
λ e = h / mv ＝ h / (2qmV) 1/2 ＝ 12.2 / (V) 1/2 (?0?3) λ e ＝ h / mv ＝ h / (2qmV) 1/2 ＝ 12,2 / (V) 1/2 (?0?3) Bajo un voltaje de aceleración de 10 KV, la longitud de onda de los electrones es sólo 0,12?0?3, que es mucho menor que la de 4000-7000?0? 3 de luz visible Por lo tanto, la resolución de los microscopios electrónicos es naturalmente muy superior a la de los microscopios ópticos, pero el diámetro del haz de electrones de un microscopio electrónico de barrido está mayoritariamente entre 50 y 100?0?3, y el volumen de reacción del elástico. La dispersión (dispersión elástica) y la dispersión inelástica (dispersión inelástica) entre electrones y núcleos atómicos serán mayores que el electrón original. El diámetro del haz aumenta, por lo que la resolución de un microscopio electrónico de transmisión es generalmente mayor que la de un microscopio electrónico de barrido. Bajo un voltaje de aceleración de 10 KV, la longitud de onda de los electrones es sólo 0,12·0?3, que es mucho menor que los 4000-7000?0?3 de la luz visible. Por lo tanto, la resolución de los microscopios electrónicos es naturalmente mucho mejor que esa. de microscopios ópticos, pero microscopios electrónicos de barrido El diámetro del haz de electrones está principalmente entre 50 - 100?0?3, y el volumen de reacción de dispersión elástica (dispersión elástica) y dispersión inelástica (dispersión inelástica) entre electrones y núcleos atómicos aumentará que el diámetro original del haz de electrones, por lo que generalmente, los microscopios electrónicos de transmisión tienen una resolución más alta que los microscopios electrónicos de barrido.
3. Una característica importante de un microscopio de barrido es su profundidad de campo extremadamente grande, que es aproximadamente 300 veces mayor que la de un microscopio óptico. Esto hace que un microscopio de barrido sea más adecuado que un microscopio óptico para observar superficies. Grandes ondulaciones. Una característica importante de un microscopio de barrido es su enorme profundidad de campo, que es aproximadamente 300 veces mayor que la de un microscopio óptico. Esto hace que un microscopio de barrido sea más adecuado que un microscopio óptico para observar muestras con grandes ondulaciones superficiales.
4. El diseño del sistema del microscopio electrónico de barrido es de arriba a abajo. El haz de electrones es emitido por el cañón de electrones, después de ser enfocado por un conjunto de lentes magnéticas, es enfocado por la apertura de protección. Apertura) Después de seleccionar el tamaño del haz de electrones (Tamaño del haz), pasa a través de un conjunto de bobinas de escaneo que controlan el haz de electrones y luego lo enfoca a través de la lente del objetivo (Lente del objetivo) y lo golpea en la pieza de prueba. Se instala un receptor de señal en la parte superior de la pieza de prueba. Se utiliza para seleccionar electrones secundarios (electrón secundario) o electrones retrodispersados (electrón retrodispersado) para obtener imágenes.
El diseño del sistema de un microscopio electrónico de barrido es de arriba a abajo. El cañón de electrones emite un haz de electrones. Después de enfocar mediante un conjunto de lentes magnéticas (lente de condensador), la apertura del condensador se utiliza para seleccionar el tamaño del haz de electrones. ). Tamaño), pasa a través de un conjunto de bobinas de escaneo que controlan el haz de electrones y luego lo enfoca a través de la lente del objetivo y lo golpea en la pieza de prueba. Se instala un receptor de señal en la parte superior de la pieza de prueba para seleccionar. Imágenes de electrones secundarios (electrones secundarios) o electrones retrodispersados (electrones retrodispersados).
5. Las características necesarias de un cañón de electrones son un alto brillo y una pequeña dispersión de energía de los electrones (Energy Spread). Actualmente se utilizan tres tipos: filamento de tungsteno (W) y hexaboruro de lantano (LaB 6). Filamento, emisión de campo (emisión de campo), diferentes filamentos tienen diferencias en el tamaño de la fuente de electrones, la cantidad de corriente, la estabilidad de la corriente y la vida útil de la fuente de electrones, etc. Las características necesarias de un cañón de electrones son un alto brillo y una pequeña dispersión de energía de los electrones (Energy Spread). Actualmente, se utilizan tres tipos: filamento de tungsteno (W), filamento de hexaboruro de lantano (LaB 6) y emisión de campo (Field Emission). Los diferentes filamentos tienen diferencias en el tamaño de la fuente de electrones, la corriente, la estabilidad de la corriente y la vida útil de la fuente de electrones. Microscopio electrónico de transmisión El microscopio electrónico de transmisión (inglés: microscopía electrónica de transmisión, abreviado TEM), denominado microscopio electrónico de transmisión, proyecta un haz de electrones acelerado y concentrado sobre una muestra muy delgada. Los electrones chocan con los átomos de la muestra y cambian su dirección. Produce dispersión de ángulo sólido. El tamaño del ángulo de dispersión está relacionado con la densidad y el grosor de la muestra, por lo que se pueden formar imágenes con diferentes colores claros y oscuros. Por lo general, la resolución de un microscopio electrónico de transmisión es de 0,1 a 0,2 nm y el aumento es de decenas de miles a millones de veces. Se utiliza para observar ultramicroestructuras, es decir, estructuras de menos de 0,2 a 0 a 8 m que no se pueden ver claramente debajo. un microscopio óptico, también conocido como "estructura submicroscópica". Principio de imagen El principio de imagen del microscopio electrónico de transmisión se puede dividir en tres situaciones:
Imagen de absorción: cuando los electrones golpean una muestra con gran masa y densidad, el principal efecto de formación de fase es la dispersión. Los lugares con un gran espesor de masa en la muestra tienen un gran ángulo de dispersión de electrones, pasan menos electrones y el brillo de la imagen es más oscuro. Los primeros microscopios electrónicos de transmisión se basaban en este principio.
Imagen de difracción: después de que la muestra difracta el haz de electrones, la distribución de amplitud de la onda de difracción en diferentes posiciones de la muestra corresponde a las diferentes capacidades de difracción de cada parte del cristal en la muestra. Cuando se produce un defecto en el cristal, la capacidad de difracción de la parte defectuosa es diferente de la de la parte intacta. Las diferentes regiones hacen que la distribución de amplitud del recipiente de difracción sea desigual, lo que refleja la distribución de los defectos del cristal.
Imagen de fase: cuando la muestra es más delgada que 100?0?3, los electrones pueden pasar a través de la muestra, el cambio de amplitud de la onda se puede ignorar y la imagen proviene del cambio de fase. Componentes Cañón de electrones: emite electrones y consta de cátodo, rejilla y ánodo. Los electrones emitidos por el tubo catódico pasan a través de los pequeños orificios de la rejilla para formar un haz de rayos. Después de ser acelerados por el voltaje del ánodo, se dirigen al condensador, que acelera y presuriza el haz de electrones.
Concentrador: Concentra el haz de electrones y puede controlar la intensidad de la iluminación y el ángulo de apertura.
Sala de muestras: Coloque la muestra a observar e instale una mesa basculante para cambiar el ángulo de la muestra. También está equipada con equipos de calefacción, refrigeración y otros.
Lente objetiva: Es una lente de corta distancia y gran aumento, que se utiliza para ampliar la imagen electrónica. La lente del objetivo es la clave para determinar la resolución y la calidad de la imagen de un microscopio electrónico de transmisión.
Espejo intermedio: Es una lente débil con aumento variable. Su función es amplificar la imagen electrónica dos veces. Al ajustar la corriente del espejo intermedio, se puede seleccionar la imagen o el patrón de difracción de electrones del objeto para su ampliación.
Lente transmisora: Es una lente potente de alta potencia, que se utiliza para ampliar la imagen intermedia y luego visualizarla en la pantalla fluorescente.
Además, hay una bomba de vacío secundaria para evacuar la cámara de muestra y un dispositivo de cámara para registrar imágenes. La estructura del microscopio electrónico de transmisión consta de dos partes: la parte principal es el sistema de iluminación, el sistema de imágenes y la sala de cámaras de observación; la parte auxiliar es el sistema de vacío y el sistema eléctrico;
1. Sistema de iluminación
El sistema se divide en dos partes: cañón de electrones y espejo convergente. El cañón de electrones consta de un filamento (cátodo), una rejilla y un ánodo. El filamento calentado emite un haz de electrones. La aplicación de voltaje al ánodo acelera los electrones. La diferencia de potencial entre el ánodo y el cátodo es el voltaje de aceleración total. Los electrones acelerados y energéticos son expulsados por los agujeros de la placa del ánodo. La energía del haz de electrones emitido está relacionada con el voltaje de aceleración y la rejilla juega un papel en el control de la forma del haz de electrones. El haz de electrones tiene un cierto ángulo de divergencia. Después del ajuste mediante el espejo convergente, se espera obtener un haz de electrones paralelo con un ángulo de divergencia muy pequeño o incluso nulo. La densidad de corriente (corriente del haz) del haz de electrones se puede ajustar ajustando la corriente del espejo convergente.
El tamaño del área de la muestra que necesita ser iluminada está relacionado con la ampliación. Cuanto mayor sea el aumento, menor será el área de iluminación, lo que requiere un haz de electrones más delgado para iluminar la muestra. El tamaño del punto del haz de electrones emitido directamente por el cañón de electrones es mayor y la coherencia es pobre. Para utilizar estos electrones de manera más efectiva y obtener haces de electrones de iluminación con alto brillo y buena coherencia para satisfacer las necesidades de los microscopios electrónicos de transmisión con diferentes aumentos, los haces de electrones emitidos por el cañón de electrones deben converger aún más para proporcionar diferentes tamaños de puntos de haz. , haz de iluminación aproximadamente paralelo. Esta tarea suele realizarse mediante dos lentes electromagnéticas llamadas condensadores. C1 y C2 en la figura representan el primer condensador y el segundo condensador respectivamente. C1 generalmente permanece sin cambios y su función es reducir el punto de intersección del cañón de electrones a una imagen reducida, reduciendo su tamaño en más de un orden de magnitud. Además, se instala un dispositivo de inclinación del haz en el sistema de iluminación, que puede inclinar fácilmente el haz de electrones dentro de un rango de 2° a 3° para iluminar la muestra en ciertos ángulos de inclinación específicos.
2. Sistema de imágenes
El sistema incluye una cámara de muestra, lente objetivo, espejo intermedio, diafragma de contraste, diafragma de difracción, espejo de proyección y otros componentes ópticos electrónicos. La cámara de muestras tiene un mecanismo para garantizar que el vacío del cuerpo principal no se destruya cuando las muestras se reemplazan con frecuencia. La muestra se puede mover en las direcciones X e Y para encontrar la posición a observar. El haz de electrones paralelo obtenido por el espejo de condensación se irradia sobre la muestra. Después de pasar a través de la muestra, transporta información que refleja las características de la muestra y forma una imagen de electrones primarios mediante la acción de la lente objetivo y el diafragma de contraste. luego es amplificada por el espejo intermedio y el espejo de proyección. La imagen electrónica final se obtiene en la pantalla fluorescente.
El sistema de iluminación proporciona un haz de electrones de iluminación con buena coherencia. Después de que estos electrones pasan a través de la muestra, transportan la información estructural de la muestra y se propagan en diferentes direcciones (por ejemplo, cuando hay un cristal). que satisface la ecuación de Bragg Cuando se ensambla el panel, se puede generar un haz difractado en una dirección que corta un ángulo de 2θ con el haz incidente). La lente del objetivo hace converger electrones de diferentes partes de la muestra con la misma dirección de propagación en un punto en su plano focal posterior. Los electrones que se propagan en diferentes direcciones forman puntos diferentes en consecuencia. El haz directo con ángulo de dispersión cero converge en el foco de la muestra. lente objetivo, formando un punto central. De esta manera se forma un patrón de difracción en el plano focal posterior de la lente objetivo. En el plano de imagen de la lente objetivo, estos haces de electrones se recombinan y forman imágenes coherentes. Ajustando la corriente de la lente del espejo intermedio de modo que el plano del objeto del espejo intermedio coincida con el plano focal posterior de la lente objetivo, se puede obtener el patrón de difracción en la pantalla fluorescente si el plano del objeto del espejo intermedio coincide con. el plano de imagen de la lente objetivo, se puede obtener una imagen microscópica. Combinando los dos espejos intermedios, la longitud y el aumento de la cámara se pueden ajustar dentro de un amplio rango.
Comparación de los caminos ópticos de los microscopios electrónicos de transmisión y los microscopios ópticos de transmisión
3. Observación de la sala fotográfica
La imagen del electrón se refleja en la pantalla fluorescente. . La luminiscencia de fluorescencia es proporcional a la corriente del haz de electrones. Sustituye la pantalla fluorescente por una placa seca electrónica y podrás tomar fotografías. La fotosensibilidad de la placa seca está relacionada con su longitud de onda.
4. Sistema de vacío
El sistema de vacío consta de una bomba mecánica, una bomba de difusión de aceite, una bomba de iones, un instrumento de medición de vacío y una tubería de vacío. Su función es eliminar el gas en el cilindro de la lente de modo que el grado de vacío del cilindro de la lente debe ser de al menos 10-5 Torr. En la actualidad, el mejor grado de vacío puede alcanzar 10-9-10-10 Torr. Si el grado de vacío es bajo, la colisión entre los electrones y las moléculas de gas provocará dispersión y afectará el contraste. También provocará ionización de alto voltaje entre la rejilla de electrones y el ánodo, lo que provocará una descarga entre electrodos. El gas restante también corroerá el. filamento y contaminar la muestra.
5. Sistema de control de la fuente de alimentación
La inestabilidad del voltaje de aceleración y la corriente magnética de la lente producirán una aberración cromática grave y reducirán la capacidad de resolución del microscopio electrónico, por lo que la estabilidad de la aceleración. El voltaje y la corriente de la lente son un criterio importante para medir el rendimiento de los microscopios electrónicos.
El circuito del microscopio electrónico de transmisión consta principalmente de las siguientes partes: fuente de alimentación de CC de alto voltaje, fuente de alimentación de excitación de lentes, fuente de alimentación de la bobina deflectora, fuente de alimentación de calentamiento del filamento del cañón de electrones, circuito de control del sistema de vacío, fuente de alimentación de la bomba de vacío, dispositivo de accionamiento de la cámara y Circuito de exposición automática.
Además, muchos microscopios electrónicos de alto rendimiento también están equipados con accesorios de escaneo, espectroscopia de energía, espectroscopia de pérdida de energía de electrones y otros instrumentos. Estructura del microscopio electrónico de transmisión y principio de obtención de imágenes Aplicaciones Los microscopios electrónicos de transmisión se utilizan ampliamente en ciencia de materiales y biología. Dado que los objetos dispersan o absorben fácilmente los electrones, el poder de penetración es bajo. La densidad y el grosor de la muestra afectarán la calidad de la imagen final. Se deben preparar secciones ultrafinas más delgadas, generalmente de 50 a 100 nm. Por lo tanto, las muestras para observación con microscopía electrónica de transmisión deben procesarse en cantidades muy finas. Los métodos comúnmente utilizados incluyen: corte ultrafino, corte ultrafino congelado, grabado por congelación, fractura por congelación, etc. En el caso de muestras líquidas, normalmente se cuelgan de rejillas de cobre pretratadas para su observación.