La tesis de Dembela
Con los continuos esfuerzos de científicos de todo el mundo, la tecnología del cultivo de tejidos vegetales se ha desarrollado rápidamente en las últimas décadas. Mediante el cultivo de tejidos no sólo se pueden producir una gran cantidad de excelentes clones, sino que también se pueden obtener varias generaciones necesarias para el ser humano.
Gracias al material, se pueden identificar haploides, triploides, poliploides y aneuploidías. La fusión celular puede romper los límites de las especies, superar la incompatibilidad de la hibridación a distancia y desempeñar un papel enorme en el cultivo de nuevas variedades de plantas y la mejora del germoplasma. Los cultivos de tejidos de células vegetales son materiales ideales para el análisis y la investigación a nivel celular. Desde la rápida propagación de plantas y el cultivo de anteras hasta el cultivo de orgánulos, la fusión de protoplastos y la tecnología recombinante de ADN, la tecnología de cultivo de tejidos vegetales se ha utilizado ampliamente en diversos campos de la ciencia vegetal y la agricultura, la silvicultura, la industria, la medicina y otras industrias, convirtiéndose en la tecnología más popular en Ciencias biológicas contemporáneas. La disciplina de la vitalidad.
1 Conceptos básicos, principios y procedimientos experimentales del cultivo de tejidos vegetales
1.1 Concepto
El cultivo de tejidos vegetales es un método para aislar órganos vegetales (puntas de raíces, tallo consejos, etc.) tecnología. ), tejidos (cambium, tejido de anteras, etc.), células (células somáticas, células germinales, etc.), embriones (embriones maduros o inmaduros), protoplastos, etc. Cultívelos en medios de cultivo preparados artificialmente en condiciones estériles y proporcióneles las condiciones de cultivo adecuadas para inducirlos a producir callos o yemas latentes o convertirse en plantas completas.
1.2 Principios
La base del cultivo de tejidos vegetales es la "totipotencia" de las células vegetales y la "regeneración" de las plantas. En 1902, el famoso botánico alemán G. Haberlandt propuso un punto de vista basado en la teoría celular: "Los órganos y tejidos de las plantas superiores pueden seguir dividiéndose hasta formar una sola célula, es decir, una célula somática vegetal, en las condiciones adecuadas". , tiene el potencial de dividirse, reproducirse y desarrollarse continuamente hasta convertirse en una planta completa". En 1943, American White descubrió accidentalmente la formación de yemas en los callos del tabaco, lo que confirmó el argumento de G. Haberlandt.
Diferentes plantas requieren diferentes condiciones de cultivo y utilizan diferentes medios. Los medios basales de uso común incluyen MT, MS, SH, N6, White, etc. En el cultivo de tejidos, la clave para cultivar nuevas plantas es si se pueden formar callos y cuerpos embrioides. Agregar una cierta concentración de hormonas exógenas al medio básico puede inducir callos, cuerpos embrioides, yemas adventicias, raíces y otros órganos, y finalmente obtener plantas regeneradas o materia secundaria.
Los materiales utilizados para el cultivo de tejidos vegetales se denominan explantes, y sus formas principales incluyen órganos, embriones, células individuales, protoplastos, etc. Dependiendo del explante, también son diferentes el tipo de medio de cultivo, las condiciones de cultivo, el tipo y la proporción de hormonas exógenas. En el cultivo de tejidos vegetales, existen muchos factores que afectan la capacidad de cultivo. La clave para el éxito o el fracaso de la inducción de callos radica en las condiciones de cultivo, y las fitohormonas son los factores clave para inducir la diferenciación de callos y plántulas verdes.
IAA, NAA y 2,4-D son las auxinas más utilizadas para la inducción de callos. La concentración requerida es de 0,01 ~ 10 mg/L. Las citoquininas más utilizadas son KT y ABA. de KT es 0,1 ~ 10 mg/L. La función principal de KT es promover la división celular y la diferenciación de callos. ABA juega un papel importante en la aparición y desarrollo de embriones somáticos de plantas. Aunque las funciones fisiológicas de varias hormonas vegetales son relativamente específicas, los efectos fisiológicos de las plantas son una manifestación integral de la interacción entre diferentes tipos de hormonas.
1.3 Procedimiento de prueba
1.3.1 Selección y preparación del medio de cultivo es la "sangre" en el cultivo de tejidos vegetales. La composición y el suministro de sangre están directamente relacionados con el crecimiento y la diferenciación. del cultivo, por lo que es muy importante comprender la composición, características y preparación del medio de cultivo.
1.3.2 La esterilización es una de las tareas importantes en el cultivo de tejidos, y generalmente se utilizan métodos de esterilización física o química. Los medios de cultivo deben esterilizarse mediante calor húmedo, como la cocción a presión normal o alta presión, los instrumentos deben esterilizarse mediante combustión, la cristalería y los utensilios resistentes al calor deben esterilizarse mediante calor seco, los materiales termolábiles deben esterilizarse mediante filtración y las superficies. de los materiales vegetales se deben esterilizar con desinfectantes, las superficies se esterilizan con spray químico y los espacios como la sala de inoculación se esterilizan con luz ultravioleta o fumigación.
1.3.3 Inoculación Cortar las raíces, tallos, hojas y otros órganos aislados esterilizados en gajos o trozos pequeños y colocarlos en el medio de cultivo. Todo el proceso de inoculación debe realizarse en condiciones estériles.
L.3.4 Cultivo: Colocar el cultivo en una sala de cultivo con ciertas condiciones de luz y temperatura para permitirle crecer, dividirse y diferenciarse para formar callos o diferenciarse aún más en plantas regeneradas.
1.3.5 Las plántulas de probeta domesticadas y trasplantadas son plántulas cultivadas en condiciones ambientales especiales, muy diferentes a las que se cultivan de forma natural. Sólo pueden trasplantarse después de haber sido domesticadas y adaptadas al entorno natural. .
2 Aplicación del cultivo de tejidos vegetales
2.1 Propagación rápida de plantas y producción de plántulas sin virus
La tecnología de propagación rápida de plantas comenzó en la década de 1960, con ovejas en Francia El hongo propaga con éxito orquídeas en grandes cantidades mediante el cultivo de la punta del tallo, iniciando la investigación y aplicación de tecnología de propagación rápida de plantas. Actualmente existen más de 65.438.000 familias y más de 65.438.000 especies, algunas de las cuales se han convertido en mercancías. Del 80 al 85% de las orquídeas del mundo están libres de virus y se reproducen rápidamente mediante cultivo de tejidos. Los tipos de plantas cultivadas se han desarrollado gradualmente desde plantas ornamentales hasta plantas hortícolas, cultivos extensivos, plantas económicas y plantas medicinales. En China, una investigación similar comenzó en los años 1970. Durante la producción se han plantado semillas de papa no tóxicas y plántulas de caña de azúcar en grandes áreas, y se han producido más de 30 tipos de plantas en producción a gran escala o en pruebas piloto. El uso del cultivo de tejidos para la rápida propagación de plantas y la producción de plántulas libres de virus no sólo puede salvar y valorar especies en peligro de extinción, sino también resolver el problema de la falta de recursos de plantas silvestres.
2.2 Cultivo de anteras de plantas y mejoramiento de haploides
El cultivo de anteras de plantas en plantas haploides y luego diploides homocigotos se puede obtener rápidamente después de duplicar los cromosomas, lo que acortará considerablemente el ciclo de reproducción. Hasta ahora se han obtenido plantas haploides de cientos de plantas en el mundo a través del cultivo de polen y anteras. Las líneas de arroz desarrolladas por científicos indios que utilizaron este método aumentaron el rendimiento entre un 15 y un 49% en comparación con el control. Corea del Sur ha desarrollado cinco variedades de arroz de alta calidad, resistentes a enfermedades y al acame. Desde la década de 1970, China ha cultivado más de 40 tipos de plantas haploides desarrolladas a partir de polen o anteras, de las cuales más de 65.438.000 son las primeras de su tipo en China. Se han obtenido más de 100 líneas endogámicas homocigotas en maíz. Para el caucho se obtuvieron plantas diploides y triploides. Sólo durante el período del "Noveno Plan Quinquenal", se desarrollaron 44 nuevas variedades de cultivos con alto rendimiento, alta calidad, resistencia al estrés y a las enfermedades, con una superficie de plantación de más de 6,6 millones de hectáreas.
2.3 Cultivo de embriones de plantas
En el mejoramiento de híbridos, los embriones híbridos a menudo abortan, por lo que las plantas híbridas se pueden cultivar eliminando los embriones de crecimiento temprano y aplicando métodos de cultivo de tejidos. Ha habido más de 100 informes sobre el cultivo de embriones inmaduros en plantas. Los científicos nacionales y extranjeros han utilizado la tecnología de cultivo de embriones de plantas para obtener una variedad de variedades recombinantes, cultivadas e híbridas de híbridos distantes.
2.4 Cultivo en suspensión de callos o células vegetales
Los metabolitos secundarios vegetales utilizados para prevenir y tratar enfermedades se pueden producir mediante cultivo en suspensión de callos o células vegetales. En los últimos años, este campo se ha desarrollado muy rápidamente. Se han estudiado más de 400 tipos de plantas y se han aislado más de 600 tipos de metabolitos secundarios a partir de células cultivadas, de los cuales más de 60 tienen un contenido mayor o igual al de la planta original y más de 20 son mayores que 19,6. en el peso seco de la planta original. Por ejemplo, la diosgenina producida a partir de callos de batata y células en suspensión se utiliza en la síntesis de fármacos esteroides. Recientemente, el cultivo celular del fármaco anticancerígeno Paclitaxel-Yew se puede cultivar en un fermentador de 75 t, que ha alcanzado el nivel de producción comercial. Además, consuelda, ginseng, coptis, geranio, etc. ha alcanzado el nivel de comercialización. Se han industrializado Catharanthus roseus, la dedalera y el tabaco; más de 20 tipos de plantas, como el pasto palillo y el cártamo, están en proceso de transición hacia la comercialización.
2.5 Fusión celular y cultivo de protoplastos
Desde 1960, el académico británico Cocking aisló con éxito por primera vez protoplastos de las raíces de plántulas de tomate. En 1990, se habían producido más de 100 plantas regeneradas con protoplastos. mi país ha obtenido más de 30 variedades de plantas regeneradas con protoplastos, incluidos importantes cultivos alimentarios y económicos, como soja, arroz, maíz, trigo, mijo, sorgo y algodón.
El cultivo de protoplastos de plantas leñosas, plantas medicinales, hortalizas y hongos también está progresando rápidamente. En el extranjero se han obtenido plantas híbridas de células somáticas intraespecíficas e interespecíficas. El cultivo de protoplastos vegetales también se puede utilizar en el estudio de la transferencia de genes exógenos, la variación clonal y la detección de mutantes, por lo que ha recibido cada vez más atención.
2.6 Cribado de mutantes de células vegetales
El cribado de mutantes de células vegetales comenzó en 1959, cuando G. Melchers obtuvo mutantes de temperatura en cultivos de células en suspensión de boca de dragón. En 1970, P.S. Carlson, H. Binding y Y.M. Heimer aislaron células auxotróficas del tabaco, líneas celulares resistentes a la estreptomicina de petunia y líneas celulares resistentes a la treonina del tabaco, respectivamente. Hasta la fecha, se han seleccionado más de 100 mutantes o variantes de células vegetales a partir de cultivos de células vegetales de 45 especies de no menos de 15 familias. Estos incluyen mutantes celulares resistentes a enfermedades, como los mutantes del maíz resistentes a la mancha foliar y los mutantes del trigo resistentes a la sarna y la pudrición de la raíz; mutantes que son resistentes al estrés adverso, tales como mutantes de arroz tolerantes a la sal y mutantes de trigo tolerantes a la sal; mutantes de células resistentes a herbicidas y mutantes de células auxotróficas, tales como mutantes resistentes a agentes desherbadores de maíz; Mutantes enanos del arroz.
2.7 Embriones somáticos de plantas y semillas artificiales
En 1958, Reinert descubrió por primera vez embriones somáticos (cuerpos embrioides) en cultivos de tejidos de zanahorias. Según estadísticas incompletas, existen más de 100 especies de plantas que pueden producir cuerpos embrioides en grandes cantidades, pertenecientes a 92 géneros y 43 familias. Algunos cultivos importantes, como el arroz, el trigo, el maíz y el mijo perla, también pueden producir cuerpos embrioides mediante cultivo in vitro. Estos cuerpos embrioides están embebidos en alginato de sodio, etc. Agregue cubierta de semilla artificial para formar semillas artificiales. Las ventajas de las semillas artificiales son: rápida reproducción y alta tasa de plántula; no se ven afectadas por el clima y pueden industrializarse durante todo el año. A principios de la década de 1980, Estados Unidos, Japón, Francia y otros países llevaron a cabo sucesivamente investigaciones sobre semillas artificiales. Mi país también llevó a cabo esta investigación durante el Séptimo Plan Quinquenal y se incluyó en la investigación nacional de alta tecnología "863". y plan de desarrollo de 1987.
2.8 Criopreservación de cultivos de células de tejidos vegetales y establecimiento de un banco de germoplasma
El descubrimiento y confirmación de la totipotencia de las células vegetales ha abierto nuevas vías para la preservación a largo plazo de los recursos de germoplasma vegetal. . El uso de tecnología de preservación a temperatura ultrabaja con nitrógeno líquido puede mantener una alta tasa de supervivencia, regenerar nuevas plantas y mantener las características genéticas originales. Por ejemplo, establecer un banco de germoplasma de criopreservación para el cultivo de meristemas del ápice de los brotes no sólo puede prevenir la variación genética y la degradación del germoplasma, sino también preservar las existencias libres de virus durante mucho tiempo.
2.9 Aplicación del cultivo de tejidos vegetales y tecnología transgénica
La construcción e investigación de la primera biblioteca de mutantes de inserción de ADN T de mi país ha sentado una buena base para la investigación de la genómica funcional del arroz en mi país. La base tecnológica y material ha contribuido positivamente a garantizar que nuestro país tenga una serie de recursos genéticos con derechos de propiedad intelectual independientes. En cooperación con el Laboratorio Abierto Clave de Biología del Arroz del Ministerio de Agricultura del Instituto de Investigación del Arroz de China y el Instituto de Fisiología Vegetal de Shanghai de la Academia de Ciencias de China, se estableció un sistema de tecnología transgénica mediada por Agrobacterium eficiente y a gran escala para introducir Se indujeron genes extraños, como el transposón de maíz AC-DS, a partir de embriones y semillas de arroz, y se obtuvieron 12.000 líneas de inserción de ADN-T independientes para construir una base de datos de mutantes de arroz.
3 Perspectivas
La investigación y aplicación del cultivo de tejidos vegetales es uno de los principales logros del progreso científico y tecnológico del siglo XX. Occurrence proporciona muchos buenos materiales experimentales y formas efectivas. A medida que los métodos de cultivo de tejidos vegetales continúan mejorando, su alcance de aplicación se ha ampliado en consecuencia.
Dado que el cultivo de tejidos se lleva a cabo bajo control artificial, es fácil comprender las razones de la diferenciación y floración de los botones florales; a través del cultivo de embriones, se pueden obtener especies híbridas o endogámicas aislando células haploides, se pueden cultivar cepas diploides homocigotas; diversidad de reproducción y acortar el tiempo de reproducción; mejorar la calidad de las plantas mediante la detección de mutantes, mejorar la resistencia al estrés y ampliar el alcance del crecimiento de las plantas criopreservadas y establecer un banco de genes para lograr el propósito de preservar especies; con alto valor medicinal y producción industrial aceleran el tiempo de producción de medicamentos y reducen la pasividad de depender únicamente de plantas naturales. La tecnología del cultivo de tejidos vegetales ha penetrado en todos los campos de la investigación científica, la producción y la vida, y mejorará día a día.
Ciencias Agrícolas de Heilongjiang 2006, (3)