¿Por qué el cebador de PCR es 2n-2?

La PCR es una reacción de amplificación en cadena de la polimerasa. Debido a que el ADN es de doble cadena, es necesario amplificar ambas cadenas al mismo tiempo durante la amplificación. Es necesario diseñar cebadores ascendentes y descendentes para amplificar ambas cadenas de ADN. al mismo tiempo porque los cebadores suelen ser dos secuencias de oligonucleótidos sintetizadas artificialmente. Un cebador es complementario a una hebra modelo de ADN en un extremo de la región diana y el otro cebador es complementario a otra hebra modelo de ADN en el otro extremo de la región diana; , y su función es polimerizar nucleótidos. Como punto de partida de acción, la polimerasa de ácido nucleico puede sintetizar una nueva cadena de ácido nucleico a partir de su extremo 3.

El contenido de GC de la secuencia del cebador es generalmente de 40 a 60. Demasiado alto o demasiado bajo no favorece el inicio de la reacción.

El contenido de GC de los cebadores ascendentes y descendentes no puede ser muy diferente.

El cebador en sí no debe tener una secuencia complementaria; de lo contrario, el cebador se doblará en una estructura de horquilla para renaturalizar el cebador.

Esta estructura secundaria afectará a la combinación de renaturalización del cebador y la plantilla debido al impedimento estérico.

El cebador en sí no puede tener 4 bases consecutivas de complementariedad.

No debe haber complementariedad entre los dos cebadores. En particular, se debe evitar la superposición complementaria en el extremo 3' para evitar la formación de dímeros de cebador y dímeros cruzados.

No pueden existir 4 bases consecutivas de complementariedad entre cebadores.

Si las estructuras cebador-dímero y horquilla son inevitables, el valor △G no debe ser demasiado alto y debe ser inferior a 4,5 kcal/mol. El valor ?G se refiere a la libertad necesaria para la formación de ADN. dobles hebras capaces.

Este valor refleja la estabilidad relativa de los pares de bases dentro de la estructura bicatenaria, de lo contrario, es fácil producir bandas de cebador-dímero y reducir la concentración efectiva de cebadores, provocando que la reacción de PCR no proceda. normalmente.

Información ampliada: El cebador aguas abajo del cebador inverso se extiende a lo largo de la hebra delantera.

Al amplificar el ADN in vitro, la doble hélice se abre parcial o completamente, no queda ningún fragmento de Okazaki y no se extenderá segmento a segmento. En teoría, tanto el cebador directo como el inverso se extienden. continuamente y están en armonía con el ADN in vivo. Hay una diferencia en la copia.

El cebador aguas arriba del cebador directo se extiende continuamente a lo largo de la cadena negativa.

La hebra positiva es la hebra sentido, también llamada hebra codificante. Generalmente se encuentra en el extremo superior del ADN bicatenario, con la dirección de izquierda a derecha 5'-3'. la secuencia es básicamente la misma que la del ARNm del gen; el cebador que se une a esta hebra es el cebador inverso; la hebra negativa es la hebra sin sentido, también conocida como hebra no codificante, que es complementaria de la hebra positiva, y el cebador. que se une a esta hebra es el cebador directo.

Hay dos cebadores en la reacción de PCR, a saber, el cebador 5' y el cebador 3'.

Al diseñar cebadores, a menudo se utiliza una hebra única de ADN como punto de referencia, y la cadena de información se utiliza a menudo como punto de referencia. El cebador del extremo 5' es el mismo que una pequeña secuencia de ADN ubicada en el extremo 5. ' extremo del fragmento a amplificar; el cebador del extremo 3' es el mismo que Una secuencia corta de ADN ubicada en el extremo 3' del fragmento a amplificar es complementaria.

Principios básicos del diseño del cebador: ① Longitud del cebador: 15-30 pb, el comúnmente utilizado es de aproximadamente 20 pb.

② Bases de cebador: el contenido de G C es preferiblemente 40-60. Muy poco G C dará como resultado un efecto de amplificación deficiente, y demasiado G C fácilmente causará bandas no específicas.

ATGC se distribuye mejor de forma aleatoria para evitar la agrupación de más de 5 nucleótidos de purina o pirimidina.

③ No debe haber ninguna secuencia complementaria dentro del cebador.

④No debe haber secuencias complementarias entre los dos cebadores, especialmente