¿Cuáles son los experimentos de verificación relevantes para m6A? Ven y echa un vistazo

Un experimento completo es inseparable de una verificación posterior. Sin más preámbulos, echemos un vistazo más de cerca a MeRIP-seq y los experimentos de verificación relacionados que existen ~

En primer lugar, si es necesario realizar el sitio de modificación m6A para Para una verificación estricta, puede utilizar el siguiente método:

m6A-IP-qPCR, también llamado MeRIP-qPCR, es decir, los anticuerpos m6A se enriquecen en ARN metilado. En el siguiente paso, se utiliza qPCR directamente. analizar el ARN enriquecido. Una técnica para cuantificar el ARN recolectado.

El proceso de modificación de m6A es inseparable de las funciones de la metiltransferasa (escritora), desmetiltransferasa (borrador) y de la proteína lectora (lectora). La siguiente figura muestra varias proteínas de unión a ARN relacionadas con la modificación de m6A:

Por lo tanto, las interacciones ARN-proteína y proteína-proteína también son el foco de la verificación experimental de seguimiento de MeRIP-seq, así que veamos Echemos un vistazo a los experimentos que verifican la interacción entre el ARN y las proteínas y las proteínas ~

Se utiliza principalmente para estudiar la unión del ARN y las proteínas en el cuerpo. Por ejemplo, detectar la unión específica de la proteína lectora y el ARN.

Este método utiliza específicamente anticuerpos contra la proteína diana para precipitar el complejo ARN-proteína correspondiente y, mediante separación y purificación, se realiza una verificación por RT-PCR o un análisis de secuenciación del ARN unido al complejo para comprender la dinámica. procesos en redes reguladoras postranscripcionales.

(METTL3 facilita la progresión tumoral mediante un mecanismo dependiente de m6A-IGF2BP2 en el carcinoma colorrectal. Molecular cancer, 2019)

Una tecnología para estudiar la interacción entre ARN y proteínas. Las sondas de ARN marcadas con biotina se utilizan para formar complejos de ARN-proteína incubándolos con una solución que contiene la proteína objetivo. El complejo puede unirse específicamente a las perlas magnéticas y así separarse de otras proteínas en la solución de incubación. Una vez eluido el complejo, se detecta la unión de ARN específico a la proteína mediante un experimento de electroforesis en gel de proteínas.

(METTL3 facilita la progresión tumoral a través de un mecanismo dependiente de m6A-IGF2BP2 en el carcinoma colorrectal. Molecular cancer, 2019)

La detección in vitro de interacciones proteína-proteína se utiliza para verificar las dos Interacciones con proteínas conocidas o detección de proteínas desconocidas que interactúan con proteínas conocidas.

Este experimento se basa en GST (glutatión-S-transferasa), que es la proteína glutatión-S-transferasa, que puede combinarse con el glutatión (Glutatión, GSH).

Fijar GSH en perlas de agarosa para formar perlas de GSH-agarosa, y fusionar y expresar proteína conocida. Si hay proteína Y que interactúa con la proteína X, se formará un complejo "perla de agarosa-GSH-GST-X-Y". Se forma y se puede separar y detectar la proteína que interactúa con la proteína X.

(Sec62 promueve la potencia y la quimiorresistencia del cáncer colorrectal humano mediante la activación de la vía Wnt/β-catenina. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2021)

Cuando las células están bajo proceso de no desnaturalización condiciones Cuando se escinde, se conservan muchas de las interacciones proteína-proteína presentes en las células intactas.

Si A se inmunoprecipita con un anticuerpo contra la proteína A (cuadrado rojo en la figura), también se puede precipitar la proteína B (cuadrado negro en la figura) que se une a A en el cuerpo. Si B es una proteína conocida, use WB para verificar la interacción entre A y B; si B es una proteína desconocida, use espectrometría de masas para identificar la proteína que interactúa con A.

(METTL14 regula el miR-19a primario modificado con metilación de M6A para promover la proliferación e invasión de células endoteliales cardiovasculares. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2020)

Se sabe que la modificación de m6A afecta la eficiencia de traducción del ARN . La secuenciación de perfiles de ribosomas (Ribo-seq) se basa en la secuenciación de ARN unido a ribosomas.

Este método enriquece el ARN traducido que está unido a ribosomas, y luego cuantifica el ARN enriquecido mediante secuenciación, cuantificando así la intensidad de la traducción.

(1. La N(6)-metiladenosina modula la eficiencia de traducción del ARN mensajero. Cell. Junio ​​de 2015;

2. Perfiles de ribosomas: visiones globales de la traducción. Perspectivas de Cold Spring Harbor en biología 2018 julio)

Existen muchos métodos para detectar la vida media del ARN. Por ejemplo, puede utilizar el inhibidor de la transcripción actinomicina D para inhibir la transcripción de genes intracelulares, recolectar ARN total en diferentes momentos y luego realizar Northern o RT-PCR para comparar cambios en la abundancia de ARNm en diferentes momentos. Como se muestra en la figura siguiente, Boxuan Simen Zhao en el artículo "Regulación de genes postranscripcionales mediante modificaciones de ARNm" describe el impacto de la modificación de m6A en la estabilidad del ARNm durante la vida media.

Además de una serie de comprobaciones de biología molecular, por supuesto, los experimentos a nivel celular y los modelos animales también son indispensables. ¡Veamos brevemente a continuación [Imagen]