Cómo diseñar cebadores para la base de datos mirbase

El miARN se puede transcribir de forma inversa utilizando cebadores de bucle de tallo y detectarse mediante métodos de sonda o colorante. Este diseño de cebador tiene un formato fijo

Diseño de cebador de miARN (método de bucle de vástago + detección por método de tinte)

Método de diseño: extremo posterior de bucle de vástago universal más 6 bases después del miARN La secuencia complementaria inversa es el cebador de transcripción inversa, el cebador directo es la secuencia que elimina las últimas 6 bases del miARN y el cebador inverso está en el bucle del tallo.

Secuencia universal de tallo-loop de transcripción inversa:

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC

Secuencia de miARN:

>mmu-miR-99b-5p MIMAT0000132 Mus musculus miR-99b-5p

CACCCGUAGAACCGACCUUGCG

El cebador de bucle de cuello de transcripción inversa mmu-miR-99b-5p es:

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCAAG

El cebador inverso para PCR cuantitativa es: TTGTCGTGGAGTCGGC

El cebador directo es: CACCCGTAGAACCGAC

Observaciones:

1 El valor de TM del cebador inverso y del cebador directo para PCR cuantitativa No haga una diferencia demasiado grande, se ha determinado la TM del cebador inverso, si la TM del cebador directo es menor, agregue algunas bases (por ejemplo: G) en el extremo 5'.

2 El método del tinte puede causar dímeros de cebador y amplificación no específica. El método de la sonda se puede utilizar para la detección. El método de la sonda es similar al método del tinte, excepto que hay más de un cebador inverso. el sitio de unión del asa del tallo y un sitio de unión de la sonda.