Edición del gen CRISPR-Cas9 mediante 7 secuenciaciones knockout verificadas

Después de obtener múltiples líneas celulares monoclonales mediante el uso de tecnología monoclonal, es necesario verificar la eliminación. Además de la detección de los niveles de expresión de proteínas, de ello dependen en última instancia los resultados de la secuenciación. El esquema de clasificación también es diferente. Debido a que anteriormente se utilizó el método de edición mediado por CRISPR-Cas9 NHEJ, el genotipo después de la edición genética se puede ver midiendo una secuencia objetivo de aproximadamente 500 pb de longitud con sgRNA como punto central. Para el método de edición CRISPR-Cas9 mediado por HDR dependiente de plantilla, el método de detección es más complejo. Lo que hay que mencionar aquí es que la edición de genes no se acaba de completar. Después de las roturas de doble cadena del ADN causadas por Cas9, hay muchas formas de reparar el ADN. La fuerza de la capacidad de reparación de la célula también determina la eficiencia de la edición de genes. Esta puede ser otra razón de la mala eficiencia de edición de diferentes celdas.

Reactivos de rutina: Kit de extracción de ADN genómico, ADN polimerasa Taq (en adelante Taq, si es posible, puede equiparse con platino? ADN polimerasa Taq de alta fidelidad), Q5? ¿ADN polimerasa de alta fidelidad (en adelante denominada Q5), kit de recuperación de gel, clonación de TA? ¿Kit con PCR? 2.1 Vector (en adelante denominado vector T4), células competentes.

Inocula células monoclonales en una placa de 6 pocillos y extrae el ADN genómico después de aproximadamente un 80 % de confluencia. Utilizando ADN genómico como plantilla, se obtuvieron bandas de genes diana mediante experimentos de Taq PCR.

Debido a que la tira de Taq DNA Polymerase P tiene una cola, se puede ligar al vector T4, por lo que se puede utilizar cualquier DNA polimerasa que le dé al producto de Taq DNA Polymerase P una cola. Si el grupo de investigación dispone de un vector de secuenciación de extremo romo, se puede utilizar la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5. Lo que hay que considerar aquí es si el producto de la PCR puede coincidir con el vector de secuenciación posterior. El resumen es el siguiente:

(1) PCR tras extracción de ADN genómico

Debido a las limitaciones del grupo de investigación, sólo disponemos del vector de secuenciación T4, lo que requiere que el producto de PCR tener cola. Sin embargo, nuestro grupo de investigación no tenía ADN polimerasa Taq de alta fidelidad, por lo que utilicé ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 para completar el experimento de amplificación por PCR y elegí 50? Sistema l, sin potenciador de GC.

(2) Purificar el producto de PCR

Someter el producto de amplificación de PCR a electroforesis en gel de agarosa y luego utilizar un kit de recuperación de gel para recuperar el producto de PCR. Este paso se puede realizar según las instrucciones del kit. Tenga en cuenta que las bandas de electroforesis en gel deben ser brillantes y brillantes, y la cantidad de recuperación debe ser suficiente. Esta pieza se puede utilizar según el manual del producto.

El producto de PCR coincide con el cebador unilateral del gen diana y se envía para secuenciación.

(2.1) Cola para que el producto de la PCR pueda conectarse al vector T.

Establecer el sistema de reacción

Incubar a 72 °C durante 20-40 minutos (esta vez usamos 40 minutos)

(3) Combinar el producto de la PCR de 3) con T. Después de la ligación del vector, las células se transforman en células competentes.

Tomemos como ejemplo el T4 Carrier de Thermomo.

Preparar la reacción

Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos

(4) Realizar amplificación clonal mediante cepillado.

(5) Envío y secuenciación de muestras

Primero envíe el producto de PCR para secuenciación y luego considere si desea enviar el vector T para secuenciación en función de los resultados de la secuenciación del producto de PCR. Si los resultados de la secuenciación del producto de PCR muestran cambios genéticos, picos anidados, etc. , se pueden enviar a colonias monoclonales para su secuenciación.

(6) Utilice el software Snapgene para comprobar los resultados de la secuenciación.

Abra el archivo de secuencia del gen objetivo y haga lo siguiente.

Cargue el archivo de secuencia para comparar y ver si la secuencia es de tipo salvaje o bimodal.

Para los métodos de edición de genes mediados por NHEJ, se basa principalmente en la eliminación de bases o la inserción de bases distintas a 3, lo que resulta en mutaciones por desplazamiento de marco en lecturas posteriores, lo que puede causar cambios en la secuencia de proteínas o en el espacio. conformación. , la proteína pierde su función original, logrando así el propósito de eliminación.

Si (1) la secuencia es de tipo salvaje, la edición del gen falla.

(2) Si la secuencia de secuenciación es un pico doble (pico anidado), significa que es un heterocigoto. Se puede desmontar manualmente para ver la secuencia del gen al mismo tiempo, un solo clon. la solución bacteriana debe enviarse para secuenciación para obtener el resultado final de la secuenciación;

(3) Si es homocigótico, significa que el alelo ha eliminado la misma base. Cuando el número de cambios de base es múltiplo de 3, la eliminación puede fallar porque no puede causar una mutación por cambio de marco. Se considera exitoso solo si el número de cambios de base no es múltiplo de 3. Como se muestra en la figura anterior, falta una base C en una hebra, lo que da como resultado una mutación por desplazamiento del marco de lectura posterior y la proteína no logra el propósito de desactivación.