Purificación de la proteína de fusión GST

En primer lugar, debe asegurarse de que la proteína objetivo esté correctamente fusionada con la etiqueta GST. Se recomienda utilizar un anticuerpo anti-GST para realizar una prueba Western en el sobrenadante de lisis. Por supuesto, si tú y tus compañeros usáis el mismo plásmido, este paso no es necesario. Si no hay ningún problema con la etiqueta y puede detectar la proteína en el peso molecular objetivo en Flow, entonces esta situación solo puede ser causada por problemas de glutatión, columna y tampón. Preste atención a las condiciones de almacenamiento y al estado del GSH que está utilizando para asegurarse de que no se oxide; cambie un lote de empaque de glutatión sefarosa o pruebe una columna utilizada por sus compañeros de clase para optimizar el pH de unión, la concentración de sal y la concentración de DTT; Ajuste las concentraciones de glutatión del tampón de elución y lavado. Incluso puedes considerar reemplazar el sistema de amortiguación si es necesario. No he visto su protocolo, así que no puedo ser más específico, pero una cosa que se debe enfatizar es no confiar completamente en el protocolo. Diferentes proteínas tienen personalidades muy diferentes. El mismo protocolo puede producir resultados completamente diferentes cuando se utilizan diferentes proteínas del mismo tipo. Por lo tanto, a menudo es necesario realizar varios niveles de experimentos ortogonales sobre diversos factores que influyen para determinar una condición que satisfaga las necesidades reales. se requiere.