Métodos y procedimientos de extracción de ADN
Secundaria:
Principio:
1. Precipitar ADN disuelto en solución de NaC1.
2. Utiliza alcohol frío para extraer ADN con menos impurezas.
3.El ADN se tiñe de azul mediante difenilamina en un baño de agua hirviendo.
Pasos del método:
1. Extraiga material nuclear: revuelva en el sentido de las agujas del reloj, un poco más rápido, un poco más pesado. 5 minutos
2. Disolver el ADN:
3. Precipitar la sustancia viscosa que contiene ADN: 300 ml de agua destilada, agitar en sentido contrario a las agujas del reloj, lentamente
4. Filtración: tomar la sustancia pegajosa
5. Redisolver: Revuelva lentamente en el sentido de las agujas del reloj. 3 minutos
6. Filtración: Tomar el filtrado.
7. Extraiga el ADN que contenga menos impurezas y agite en el sentido contrario a las agujas del reloj, un poco más lento. 5 minutos
8. Identificación del ADN: baño maría en ebullición durante 5 minutos
Universidad
La extracción del ADN se divide en tres pasos básicos. El método específico de cada paso se puede determinar según el tipo de muestra. las sustancias que afectan la extracción y los pasos posteriores Diferentes y diferentes.
Utilice molienda o sonicación para alterar las células y agregue detergente para eliminar los lípidos de la membrana.
Agregue proteasa, precipitación con acetato o extracción con fenol/cloroformo para eliminar proteínas intracelulares, como las histonas unidas al ADN.
Precipita el ADN en etanol frío o alcohol isopropílico. Debido a que el ADN es insoluble en alcohol y se pega, este paso también puede eliminar la sal.
Además, actualmente existen kits comerciales para la extracción de ADN mediante el método de la columna de adsorción.
2. Disrupción celular
Las bacterias tienen paredes celulares duras y las células deben romperse primero. Hay tres métodos; ① método mecánico: tratamiento ultrasónico, trituración, homogeneización; ② método de reactivo químico: tratamiento de células con SDS; ③ método enzimático: agregar lisozima o helicasa puede romper la pared celular.
3. Varios métodos de extracción de ADN
(1). Método de sal concentrada
Aprovechando la diferente solubilidad del ARN y el ADN en el electrolítico. solución, el método común para separar los dos es extraer con cloruro de sodio 1 M. El moco de DNP obtenido se agita con cloroformo que contiene una pequeña cantidad de octanol para emulsionar y luego se centrifuga para eliminar la proteína. permanece en la fase acuosa y En medio de la fase de cloroformo, y el ADN está en la fase superior de agua, use 2 veces el volumen de etanol 95 para precipitar la sal de sodio del ADN.
B. use una solución de 0,15 MNaCL para lavar repetidamente la solución de alteración celular para eliminar RNP, y luego use Extraiga la proteína desoxirribosa con NaCL 1 M y luego elimine la proteína de acuerdo con el método de cloroformo---alcohol iso.
Comparación de Dos métodos, el último método puede causar una menor degradación de los ácidos nucleicos.
C. Al extraer ADN de una solución diluida de ácido clorhídrico, agregar una cantidad adecuada de detergente, como SDS, puede ayudar a separar las proteínas y el ADN. Durante el proceso de extracción, para inhibir la degradación del ADN por la DNasa en el tejido, se agrega citrato de sodio a la solución de cloruro de sodio como agente de fusión para los iones metálicos. Generalmente, NaCL 15 M, citrato de sodio 0,015 M, denominados colectivamente solución SSC. , se utiliza para extraer ADN (2). Método de detergente aniónico: use SDS o xilato de sodio y otros detergentes para desnaturalizar las proteínas, y el ADN se puede extraer directamente de materiales biológicos, ya que el ADN y las proteínas en las células a menudo dependen de la atracción electrostática. coordinación Debido a que los detergentes aniónicos pueden destruir este enlace de valencia, los detergentes aniónicos se usan comúnmente para extraer el ADN. Método de extracción con fenol: el fenol actúa como un desnaturalizante de proteínas e inhibe la degradación de la ADNasa. el homogeneizado se trata con fenol, ya que se ha roto el enlace entre la proteína y el ADN, la superficie de la molécula de proteína contiene muchos grupos polares que son similares al fenol y son compatibles con él. Las moléculas de proteínas se disuelven en la fase de fenol, mientras que el ADN se disuelve en la fase acuosa. Después de la centrifugación, retire la capa acuosa y repita la operación varias veces. Luego combine las fases acuosas que contienen ADN. Aprovechando la insolubilidad de los ácidos nucleicos en alcohol, use etanol para precipitar el ADN.
En este momento, el ADN es una sustancia muy viscosa y se puede enrollar en una bola con vidrio y sacarla. La característica de este método es mantener el ADN extraído en su estado natural
(4). Método de extracción con agua: aprovechando la propiedad del ácido nucleico de disolverse en agua, después de romper las células del tejido, se utiliza un nivel bajo. -solución salina para eliminar el ARN y luego disolver el precipitado en agua para disolver completamente el ADN en el agua. Recoger el sobrenadante después de la centrifugación. Añadir cloruro de sodio sólido al sobrenadante para ajustarlo a 2,6 M. Añadir 2 veces el volumen de 95. etanol y revuelva inmediatamente. Luego lave respectivamente con etanol 66, 80 y 95 y propileno de cobre, y finalmente seque al aire para obtener la muestra de ADN. El ADN extraído por este método tiene un mayor contenido de proteínas, por lo que generalmente no lo es. Este método se puede mejorar para eliminar la proteína durante el proceso de extracción. Agregue SDS.