Secuencia de repetición SSR

Los genomas de los organismos, especialmente los organismos superiores, contienen una gran cantidad de secuencias repetitivas, que pueden dividirse en secuencias repetidas en tándem (TRS) y secuencias repetidas dispersas (DRS) según su distribución en el genoma. Entre ellas, las secuencias de repetición en tándem se componen de unidades de repetición relacionadas, conectadas de extremo a extremo y dispuestas en tándem. Se encuentran dos tipos principales de secuencias repetidas en tándem: una está compuesta por genes funcionales (como los genes de ARNr y histonas); Las secuencias repetidas en tándem se pueden dividir en ADN satélite, ADN microsatélite y ADN microsatélite según la longitud de la unidad de repetición. El ADN microsatélite, también conocido como repetición de secuencia simple (SSR), se refiere a un tramo de ADN compuesto por múltiples repeticiones de 1 a 6 nucleótidos. Está ampliamente distribuido en diferentes partes del genoma y generalmente tiene menos de 200 pb de longitud. Los estudios han demostrado que los microsatélites son muy abundantes en los genomas eucariotas y, a menudo, están distribuidos aleatoriamente en el ADN nuclear. Investigación sobre Arabidopsis, maíz, arroz, trigo, etc. En las plantas, también se demostró que los microsatélites son abundantes y están distribuidos uniformemente por todo el genoma de la planta. Sin embargo, la frecuencia de los microsatélites varía mucho en diferentes plantas. Por ejemplo, las distribuciones de frecuencia de las dos unidades repetidas de dinucleótidos más comunes (AC)n y (GA)n en arroz, trigo, maíz y tabaco son diferentes entre los principales cultivos. Se estima que hay 3000 repeticiones de secuencia (AC)n y 6000 repeticiones de secuencia (GA)n en el trigo, siendo la distancia promedio entre las dos repeticiones de 704 kb y 440 kb respectivamente, mientras que hay aproximadamente 1000 repeticiones de secuencia (AC)n. se repite en arroz una secuencia de n repeticiones y aproximadamente 2000 (GA)n repeticiones, con una distancia promedio entre repeticiones de 450 kb respectivamente.

Además, también se han encontrado en plantas algunas secuencias repetidas de tri y tetranucleótidos, de las cuales (AAG)n y (AAT)n son las más comunes. El número y la distribución de SSR también difieren en monocotiledóneas y dicotiledóneas, con un promedio de 64,6 kb y 21,2 kb, respectivamente. También se descubrió que los tipos de SSR repetidos de mono y dinucleótidos se ubicaban principalmente en regiones no codificantes, mientras que algunos tipos de trinucleótidos se ubicaban en regiones codificantes. Además, también se han informado algunos microsatélites en los genomas de cloroplastos, principalmente repeticiones de secuencias A/T. Se descubrió que el número de unidades repetidas en los microsatélites era muy variable, lo que se manifiesta como una variación aneuploide en el número de microsatélites o las secuencias de las unidades repetidas pueden no ser idénticas, lo que resulta en polimorfismo en múltiples loci. Si se pueden revelar estas variaciones, podremos descubrir polimorfismos en diferentes SSR en diferentes especies e incluso en diferentes individuos. Sobre la base de esta idea, se desarrollaron etiquetas SSR. Los marcadores SSR, también conocidos como sitios de microsatélites de etiquetas de secuencia, abreviados como STMS, son uno de los marcadores de microsatélites más utilizados. Dado que la secuencia flanqueante de un microsatélite específico en el genoma suele ser una secuencia única altamente conservada, los fragmentos de ADN que flanquean el microsatélite se pueden clonar y secuenciar, y luego se puede realizar la amplificación por PCR utilizando cebadores sintetizados artificialmente basados ​​en la secuencia flanqueante del microsatélite. Agregue un único lugar de microsatélite. Debido a la variación en el número de unidades repetidas de un único locus de microsatélites, la variación en la longitud de los productos de amplificación individuales conduce a polimorfismos de longitud, llamados polimorfismos de longitud de secuencia simple (SSLP). Cada locus amplificado representa un par de alelos para este locus. Debido a que el número de repeticiones SSR varía mucho, los marcadores SSR pueden revelar polimorfismos mucho mayores que los RFLP. Este es el principio de los marcadores SSR. En comparación con otros marcadores moleculares, los marcadores SSR tienen las siguientes ventajas: ① Son abundantes, cubren todo el genoma y revelan un alto grado de polimorfismo ② Tienen las características de múltiples alelos y proporcionan un alto contenido de información (3); Se heredan de manera mendeliana. Rendimiento * * * dominancia; ④ Cada locus está determinado por la secuencia de cebadores diseñada, lo que facilita la comunicación y la cooperación entre diferentes laboratorios para desarrollar cebadores. Por lo tanto, esta tecnología se ha utilizado ampliamente en la construcción de mapas genéticos, calibración de genes diana y dibujo de huellas dactilares. Sin embargo, cabe señalar que el establecimiento de marcadores SSR requiere investigación básica como clonación, secuenciación, diseño artificial de cebadores sintéticos, posicionamiento de marcadores y mapeo, por lo que su costo de desarrollo es bastante alto y los laboratorios deben cooperar para desarrollar más marcadores.

Dado que los marcadores SSR tienen un gran valor de aplicación y una fuerte especificidad de especie, se han estudiado marcadores SSR en algunos cultivos importantes y también se han desarrollado cebadores STMS en conjunto. Repeticiones de secuencia simple (SSR)

Las repeticiones de secuencia simple (SSR) también se denominan ADN microsatélite. La secuencia central tiene de 1 a 6 pb. La más común es la secuencia de repetición de dinucleótidos, concretamente (CA) n It. tiene la misma estructura de secuencia central que (TG) n, y el número de unidades repetidas es de 10 a 60. Su alto grado de polimorfismo proviene principalmente de diferencias en los números de concatenación. El principio básico del etiquetado SSR: diseñar cebadores basados ​​en las secuencias complementarias en ambos extremos de la secuencia del microsatélite y amplificar el fragmento del microsatélite mediante una reacción de PCR. Debido al diferente número de repeticiones en tándem de la secuencia central, la PCR puede amplificar productos de PCR de diferentes longitudes. Los productos amplificados se someten a electroforesis en gel, el genotipo se determina en función del tamaño de los fragmentos separados y se calcula la frecuencia del alelo. . En los eucariotas, hay muchas repeticiones de secuencias simples de 2 a 5 pb, llamadas "ADN microsatélite". Las secuencias en ambos extremos están altamente conservadas y se pueden diseñar cebadores dobles para que la amplificación por PCR revele polimorfismos.

SSR tiene las siguientes ventajas: (1) Generalmente detecta un único locus multialélico; (2) Los microsatélites se heredan de forma dominante, por lo que se pueden distinguir heterocigotos y homocigotos (3) Se requiere menos ADN. Obviamente, cuando se utiliza la tecnología SSR para analizar polimorfismos de ADN de microsatélites, es necesario conocer la información de la secuencia de ADN en ambos extremos de la secuencia repetida. Si no se puede buscar directamente en una base de datos de ADN, primero se debe secuenciar. Un compuesto se refiere a dos o más secuencias centrales en tándem separadas por tres o más bases consecutivas no repetitivas, pero el número de repeticiones de esta secuencia central continua no es inferior a 5. Por ejemplo: atatatatatatatataggatatatatata

Entre estos tres tipos, el tipo completo es una de las etiquetas SSR más utilizadas. Distribución de SSR en genomas de plantas Los SSR están ampliamente distribuidos en los genomas de varios eucariotas, con un SSR cada 10 a 50 KB. La cantidad de SSR en los mamíferos es aproximadamente de 5 a 6 veces mayor que la de las plantas. En las plantas, hay un SSR de 23,3 kb en promedio. El número de SSR en las dicotiledóneas es mayor que en las monocotiledóneas. La distancia media entre dos SSR es de 21,2 kb para el primero y de 64,6 kb para el segundo. El número de SSR en el ADN nuclear es mayor que el del ADN citoplasmático. La mayoría de las repeticiones de una sola base y de 2 bases existen en regiones no codificantes, y las repeticiones de 3 bases se encuentran principalmente en regiones codificantes. Aprender de secuencias de otras especies relacionadas.

Desarrollamos nuestros propios cebadores SSR mediante selección y secuenciación de bibliotecas.

Busque secuencias que incluyan SSR a partir de secuencias existentes mediante consultas en bases de datos de ácidos nucleicos y diseñe cebadores. Extracción de ADN; amplificación por PCR; electroforesis y desarrollo de color; fotografía y registro de tiras de electroforesis;

Los métodos de electroforesis para la separación de productos de PCR incluyen principalmente: electroforesis en agarosa de alta concentración (4 geles solo pueden resolver diferencias de 4 a 6 pb); electroforesis en gel de secuencia de poliacrilamida desnaturalizante;

Dado que los fragmentos amplificados son cortos (generalmente menos de 300 pb) y las diferencias entre genes son pequeñas (generalmente unos pocos pb), se suele utilizar la electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución. Aunque el procedimiento del gel desnaturalizante es más problemático que el del gel no desnaturalizante, tenga en cuenta que aparecerán artefactos artificiales en el gel no desnaturalizante: las moléculas heterodúplex, como los heterocigotos SSR, aparecerán con 3-4 bandas en lugar de 2 bandas normales. , que interferirá con las estadísticas alélicas, recomendamos utilizar electroforesis en gel desnaturalizante en el análisis SSR.

Los métodos de desarrollo del color de los productos de amplificación por PCR incluyen: autorradiografía isotópica; método de marcado con tinte fluorescente; método de desarrollo del color con bromuro de etidio; tinción con plata (este método se usa comúnmente).