Descripción general de los métodos de extracción de ARN
1. Método de ultracentrifugación de cloruro de cesio con isotiocianato de guanidina.
Principio: la proteína desnaturalizante isotiocianato de guanidina se utiliza para inhibir eficazmente la actividad de la ribonucleasa. Después de la ultracentrifugación en gradiente de densidad en medio de cloruro de cesio con una densidad inicial de 1,78 g/ml, el ARN precipitó en el fondo del tubo, mientras que el ADN y la proteína estaban en el sobrenadante. Con este método, no solo se puede obtener ARN de alta calidad, sino que también se puede aislar simultáneamente ADN cromosómico celular.
Este método es especialmente adecuado para la extracción de ARN de muestras de tejido con largos tiempos de congelación, difícil separación de citoplasma y núcleo, y de células de tejido ricas en ribonucleasa (como el páncreas). El ARN extraído mediante este método es de buena calidad y tiene una alta tasa de éxito, y se ha convertido en un método rutinario para extraer ARN de células de mamíferos. Sus desventajas son una operación compleja, un proceso largo y un número limitado de muestras extraídas a la vez.
2. Método de clorhidrato de guanidina-disolvente orgánico
Este método fue mejorado por MacDonald 1987 sobre la base del método de Strohman. Es adecuado para extraer ARN total de células sin ultracentrifugación ni equipo. . Utiliza clorhidrato de guanidina para inhibir las ribonucleasas, homogeneizar y lisar células, eliminar proteínas mediante extracción con disolventes orgánicos y eliminar ADN mediante precipitación selectiva de moléculas de ARN. La calidad del ARN extraído es buena, pero toda la operación es compleja y requiere mucho tiempo.
3. Método de cloruro de litio-urea
Este método fue descrito por primera vez por Auffray. Una alta concentración de urea desnaturaliza las proteínas al tiempo que inhibe la RNasa, y 3 mol/L de LiCl precipita selectivamente el ARN. Su desventaja es que a veces hay contaminación del ADN y el ARN que precipita con LiCl perderá algo de ARN de pequeño peso molecular, como el 5ARN. Su ventaja es que es rápido y sencillo, y es especialmente adecuado para extraer ARN de una gran cantidad de muestras y una pequeña cantidad de células de tejido. Su calidad puede cumplir con los requisitos del análisis Northern, extracción oligo (dT) de ARNm y SINasa. o experimentos de protección de ARNasa. Este método puede extraer alrededor de 107 células y el ARN total es de aproximadamente 10? g.
4. Método de fenol caliente
Este método se utiliza principalmente para extraer ARN de una pequeña cantidad de muestras de células. El rendimiento no es alto, pero es simple y fácil de realizar. llevar a cabo.
5. Método de extracción rápida
Este método se utiliza principalmente para cultivar células. Utilice 0,5 SDS para lisar células, utilice extracción con fenol para eliminar precipitados de proteínas y ADN y purificar rápidamente el ARN.
6. Método de extracción de ARN citoplásmico
Este método es adecuado principalmente para células cultivadas. Primero se eliminan los núcleos, luego las proteínas se digieren con proteinasa K y se eliminan mediante extracción con fenol/cloroformo. La operación es simple, se pueden operar varias muestras al mismo tiempo y la mayoría de los pasos se realizan a temperatura ambiente. El ARN extraído es de alta calidad y puede satisfacer las necesidades de experimentos como el sistema de traducción libre de células in vitro, la síntesis de ADNc, la extensión de cebadores y la protección de nucleasa SI. El rendimiento de ARN extraído mediante este método suele oscilar entre 30 y 500 µ. Celdas G/107.
7. Extraer simultáneamente ARN y ADN celular mediante el método de fenol-cloruro de litio.
Basado en el método informado por Elion y Warner, Sandeep et al. mejoraron el método en 1990. Lisa las células con fenol y SDS, desnaturaliza y despolimeriza proteínas, inhibe las ribonucleasas y protege el ADN con EDTA. Finalmente, según las diferentes velocidades de precipitación de ARN y ADN en Li se consigue la separación de ADN y ARN. Todo el proceso se completa en 2 horas. El ARN se puede utilizar para análisis Northern y el ADN se puede utilizar para digestión con endonucleasa y experimentos de hibridación Southern.
8. Método de extracción rápida con fenol en caliente en un solo paso
Basado en el método de extracción rápida de ARN informado por Shomczynki y Sacchi en 1987, la American Promega Company combinó orgánicamente estos reactivos en uno solo. El kit de ARN total facilita la operación y destaca las siguientes ventajas: 1) El inhibidor de RNasa más potente, isotiocianato de guanidina, b-mercaptoetanol y el detergente N-lauril sarcosinato se utilizan en combinación.
Inhibe la degradación del ARN, mejora la disociación de complejos de nucleoproteínas, separa el ARN y las proteínas en soluciones y mejora la tasa de extracción del ARN 2) El ARN ingresa selectivamente a la fase acuosa, no contiene ADN ni proteínas y se precipita fácilmente con isopropilo; alcohol concentrado, adecuado para extraer ARN de células en una cantidad grande o pequeña de tejido 3) Se puede procesar una gran cantidad de muestras en 3 horas, omitiendo el paso de ultracentrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio y la precipitación selectiva con etanol o precipitación con LiCl a largo plazo; utilizado por otros métodos. La precipitación de LiCl no sólo provoca ARN pequeños (