Traducción del virus de la hepatitis B
En este estudio, confirmamos in vitro que los vectores adenovirales pueden transferir el genoma del VHB con capacidad de replicación a los hepatocitos y, en experimentos con vectores, el genoma del VHB también se puede transferir al hígado de ratón. Los genomas virales transducidos en células o ratones pueden iniciar de manera eficiente la replicación del virus del ADN hepático y la secreción de partículas virales infecciosas. Nuestros resultados experimentales indican que el ADNccc está definitivamente presente después de la transferencia del genoma adenoviral, además de todos los demás intermediarios de replicación de los hepadnavirus. Esto sugiere que la replicación de HBV y DHBV en células transducidas es al menos parcialmente independiente de los genomas lineales suministrados por vectores, sino que utiliza sus plantillas transcripcionales nativas. El curso temporal de la replicación viral y la regulación de la replicación del DHBV por la proteína L es muy similar al encontrado en la infección natural. La transferencia de genes mediada por vectores de adenovirus puede iniciar eficazmente la replicación del VHB y el DHBV a través de las barreras entre especies, lo que permite estudiar la replicación viral y su regulación en animales de experimentación característicos.
Además, la transferencia del genoma del VHB mediada por vectores adenovirales nos permite estudiar la capacidad de células de diferentes especies para soportar la replicación del VHB, nos permite estudiar la determinación de la capacidad de replicación de mutantes virales y nos permite estudiar el papel regulador de las proteínas virales en el ciclo de vida viral. La detección de cccDNA en células heterólogas después de la transferencia mediada por adenovirus de genomas del virus hepatDNA nos permite estudiar qué pasos en el ciclo de replicación del virus hepatDNA están respaldados por varias células y analizar los determinantes celulares. Creemos que la replicación del VHB sólo puede iniciarse bajo el control del promotor endógeno del VHB. Esto hace posible estudiar la capacidad de replicación de mutantes virales y la función knockout dirigida de las proteínas reguladoras virales.
En nuestro estudio, también proporcionamos evidencia de que, a diferencia del DHBV, las proteínas de la envoltura viral L y M del virus HBV no son responsables de regular la reentrada de las nucleocápsides de la progenie porque el HBV-L El genoma no sobreamplifica el ADNcc, mientras que el genoma DHBV-L sí lo hace. Estos datos son consistentes con los observados en estudios con ratones transgénicos VHB-L. La cantidad de cccDNA contenida en cada hepatocito de ratones transgénicos es
Los métodos para iniciar la replicación del VHB incluyen la transfección de virus de hepatDNA clonados (52) en células cultivadas para generar células transfectadas de manera estable (47) o el establecimiento de animales transgénicos ( 18); transferencia del gen del VHB mediada por baculovirus en células de hepatoblastoma (8); e inyección directa o transferencia mediada por liposomas catiónicos de ADN viral desnudo en el hígado del animal (11, 12, 48, 53, 56). Sin embargo, la transfección de ADN no es muy eficaz para iniciar la replicación del VHB en la mayoría de las líneas de hepatocitos y es ineficaz para iniciar la replicación del VHB en cultivos primarios de hepatocitos. Es imposible predecir si se ha introducido en cada célula un número elevado de copias de moléculas de ADN.
La transferencia de genes mediada por adenovirus tiene sus ventajas únicas. En primer lugar, se puede transducir una gama más amplia de células primarias e inmortalizadas con vectores adenovirales, y el número de genes transferidos se puede controlar mediante la dosis del vector adenoviral recombinante (42). En segundo lugar, de todos los vectores de administración de genes conocidos, los vectores adenovirales pueden transferir genes extraños de manera más eficiente a los hígados de muchos animales de experimentación diferentes (4, 30). Después de ingresar al hígado, infectan principalmente los hepatocitos (22), el sitio natural de infección y replicación del VHB. En tercer lugar, la replicación de los virus hepatDNA utilizando vectores adenovirales se inicia mediante plantillas extracromosómicas, que es lo mismo que la infección natural con el VHB.
La transferencia de genes mediada por adenovirus tiene las mismas ventajas que los baculovirus. Recientemente, nuestro laboratorio también informó que el baculovirus también se puede utilizar como vector que porta 1,3 veces el genoma del VHB de longitud completa para transferir el virus a células de hepatoblastoma cultivadas HepG2 (8). El nivel de replicación del VHB se puede ajustar cambiando la cantidad de virus recombinante utilizado (8). Por lo tanto, podríamos comparar la cantidad de progenie de VHB liberada después de la infección de células con 20 efu/célula de AdHBV y la cantidad de progenie de VHB liberada después de la infección de células con 200 UFP/célula de baculovirus VHB (9). De acuerdo con los resultados encontrados en este estudio, la replicación espontánea del VHB se estableció después de la transfección lineal del genoma viral.
Sin embargo, los baculovirus tienen sus puntos débiles como vectores. El baculovirus ingresa a los hepatocitos de los mamíferos a través de endosomas inespecíficos en lugar de hacerlo mediado por receptores (3, 23). A diferencia del adenovirus, el baculovirus media la transducción de múltiples copias de ADN por célula (23).
Además, la transferencia de genes mediada por baculovirus está sujeta a restricciones específicas de cada especie. Lo más importante es que los vectores de baculovirus tradicionales no son adecuados para mediar la transferencia de genes en animales de experimentación porque los baculovirus son eliminados rápidamente por el sistema del complemento en el cuerpo (24).
Por otro lado, los vectores adenovirales pueden transducir genes virales en hepatocitos cultivados in vitro e in vivo en experimentos con animales (26). En este estudio, demostramos por primera vez que los vectores adenovirales son adecuados para establecer un modelo animal pequeño de replicación del VHB, que se inicia mediante el genoma extracromosómico del VHB. Los ratones son probablemente los animales más útiles para el análisis experimental de la infección por VHB en diversos niveles moleculares y clínicos porque son fáciles de criar, genética e inmunológicamente fáciles de restringir según sea necesario, y los ratones pueden proporcionar muchas variantes genéticas útiles. Ahora se pueden utilizar ratones infectados con AdHBV para detectar la capacidad de replicación de variantes virales y su correlación con la patogénesis de manera más temprana y rápida (11, 18, 38, 40). Por supuesto, es probable que los modelos establecidos de replicación y reciclaje viral a largo plazo estén limitados por la respuesta inmune del huésped al vector de adenosis (6, 26). Además, los efectos de los vectores adenovirales sobre el metabolismo celular y el crecimiento celular, así como la citotoxicidad de los vectores adenovirales, pueden limitar la aplicación del AdHBV recombinante en ciertos problemas específicos. Para superar estas respuestas inmunitarias no es necesario utilizar ratones inmunodeprimidos, que son técnicamente exigentes y tienen una investigación limitada sobre la inmunología y patogénesis de la infección por VHB. Para establecer modelos de replicación del VHB a largo plazo, podemos aprovechar los nuevos avances en la tecnología de vectores adenovirales (1), protocolos experimentales inmunosupresores a corto plazo (6) o animales de experimentación que sean específicamente tolerantes a los vectores adenovirales.